副溶血性弧菌ERIC-PCR分型及毒力基因检测研究

目的:建立副溶血性弧菌ERIC-PCR分子分型技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNAERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测,以了解不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况。方法:提取副溶血性弧菌基因组DNA,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析,并以相似性系数构建聚类图;通过PCR方法对直接耐热溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)进行检测。结果:26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926;只在临床分离株中检测到TDH基因,而除一株标准菌株外,所有菌株都未检测到TRH基因。结论:研究显示ERIC-PCR可从分子水平对副溶血性弧菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,同时结合毒力基因检测,能够为副溶血性弧菌食物中毒疾病的预防和流行病学调查提供科学依据。

MPCR检测食品中大肠杆菌O157和单核增生李斯特氏菌的研究

根据大肠杆菌O157(Escherichia coliO157,E.coliO157)的志贺样毒素基因slt和"黏附抹平"因子eaeA基因、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytohenes,LM)的编码溶血素O的hlyA基因和毒力基因plcA,分别设计上游和下游的slt、eaeA、hlyA和plcA四对引物,对应扩增片段依次为780、450、708、600bp。通过对单管多重PCR(multiplex PCR,MPCR)扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件,如Mg2+浓度、dNTPs浓度和退火温度等的优化,建立快速检测大肠杆菌O157和单增李斯特菌的多重PCR方法,该方法能同时检测到0.50ng的E.coliO157和单增李斯特菌基因组DNA,并且操作简便、快速,具有良好的敏感性和特异性,能够快速实现对食品中多种致病菌的诊断和监控。

基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立

建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法,为3种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。分别选取编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、沙门氏菌肠毒素(stn)基因和致泻性大肠杆菌O157志贺样毒素(slt)基因设计引物和探针,进行三重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测,仅3种菌得到阳性扩增结果,证明此方法具有很高的特异性。3种致病菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8pg。对模拟食品样品进行直接检测,结果与常规细菌学培养结果一致,检测限为50CFU/mL。结果表明:所建立的基因芯片检测方法特异性好,灵敏度高,为食源性致病菌的检测提供了理想手段,有良好的应用前景。