假坚强芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的原核表达纯化与结晶

丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase,Ald)是一种NAD+依赖性的氨基酸脱氢酶,能可逆地催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸和氨.实验以假坚强芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶为研究对象,将目的基因克隆到p ET-22,b(+)原核表达载体上,并在大肠杆菌中完成蛋白的高效表达.通过镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化方法,得到了高纯度的目的蛋白.利用气相扩散法对目的蛋白进行结晶,最终得到分辨率为0.31,nm的蛋白晶体.

谷胱甘肽亲和层析介质的制备条件及其层析特性研究

以琼脂糖凝胶4FF（Sepharose 4 Fast Flow）为基质,1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDGE）为活化剂,通过活化、偶联谷胱甘肽（GSH）,得到GSH亲和层析介质.实验结果表明：活化及偶联的优化条件为10,m L基质加入0.42,g Na OH、15,m L二甲基亚砜（DMSO）、15,m L BDGE,反应温度为40,℃,反应时间为6,h;偶联溶液p H 6.5,反应温度为37,℃,反应时间为24,h.在此条件下,环氧基修饰密度可达60~65,μmol/m L;所制备的介质载量为（14.19±0.98）mg/m L.以此介质对谷胱甘肽S–转移酶（GST）、融合蛋白GST-Bcl-2、GST-Ald、GST-PTPN12进行纯化,结果表明,该介质纯化效果较好、载量高、稳定性能较好,可重复使用.

从猪血中提纯食品级血红素的研究

利用冰醋酸法从猪血中提纯食品级血红素.以血红素的纯度和得率为响应指标,采用单因素法和响应面法确定冰醋酸法提纯血红素的最佳工艺为:冰醋酸体积(m L)与血球液质量(g)比3.93、氯化钠添加量2.09%、反应温度98,℃、反应时间50,min.在该条件下,样品中血红素的纯度和得率分别为93.29%、60.98%.

抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体定点偶联药物的制备及其抗肿瘤活性评价

目的通过杂交瘤技术获得抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)单克隆抗体,并制备抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC),评价ADC的抗肿瘤活性。方法采用免疫雄性BALB/c小鼠的方式获得高亲和力抗GPC3单克隆抗体,采用ELISA、流式细胞术检测抗体对抗原的亲和力及在肿瘤细胞的内吞率;并通过定点偶联技术获得DAR(drug-to-antibody ratio)为2的ADC药物,细胞杀伤试验检测其对肝癌细胞HepG2和Hep3b的增殖抑制效果。结果抗体16C8-8E6在蛋白水平有很高的亲和力,EC_(50)为2.51 ng/mL,细胞水平(高表达GPC3的稳转株4E1、Hep3b、HepG2)亲和力明显高于原研抗体GC33(t分别为14.9、13.0和12.9,P均<0.05),在高表达GPC3的稳转株4E1的荧光强度为20542±107;内吞率优于原研抗体GC33,48 h内吞率达73.9%。16C8-8E6-ADC对肝癌细胞HepG2和Hep3b有一定的抑制增殖活性。结论成功获得靶向GPC3的单克隆抗体,为靶向GPC3的免疫疗法研究奠定了基础。