冷鲜鸡在微冻贮藏过程中的菌群结构变化

为揭示冷鲜鸡在微冻贮藏过程中的微生物变化规律,为微冻保鲜提供理论依据,本实验采用16S rRNA高通量测序技术解析冷鲜鸡在微冻贮藏条件下不同储藏时间菌群结构的变化规律。结果显示:冷鲜鸡在-3℃微冻贮藏过程中Shannon指数下降、Simpson指数升高,微生物多样性降低;丰富度指数(Ace指数和Chao1指数)随着贮藏时间先下降后上升,在贮藏第4 d时达到峰值,而后又逐渐降低;在门水平,冷鲜鸡在微冻贮藏过程中优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteriota)和绿弯菌门(Chloroflexi),变形菌门相对丰度随着贮藏时间的延长而增加,其他菌门则降低;在属水平,冷鲜鸡优势菌属为假单胞杆菌属、不动杆菌属、希瓦氏菌属和嗜冷杆菌属,随着贮藏时间的延长,假单胞杆菌属相对丰度增加,不动杆菌、希瓦氏菌属、嗜冷杆菌属等微生物的丰度降低,贮藏第28天时,主要为假单胞杆菌属,其余菌属各自占比不足1%。由此可知,假单胞杆菌属是冷鲜鸡在微冻贮藏环境下的优势腐败菌。

肉鸡养殖质量安全控制之生物安全技术

《中华人民共和国生物安全法》于2021年4月15日起正式实施,生物安全被提升到国家战略高度。肉鸡养殖的生物安全技术是阻断病原微生物进入鸡群而采取的相应措施,主要包括养殖场的选址、总体布局等结构性方面的生物安全措施和投入品、消毒防疫、粪污及病死鸡无害化处理等管理性方面的生物安全措施,其目的是“阻止传染源、切断传播途径和保护易感动物”。健全的生物安全技术体系是保障肉鸡健康养殖的关键因素,能够切实保障肉鸡养殖过程中的健康与安全。

江苏市售禽肉中弯曲杆菌的检测及耐药性分析

为了解江苏市售禽肉中弯曲杆菌的污染及耐药情况,从江苏省10个市区农贸市场及超市采集252份新鲜鸡肉、鸭肉、鸽肉样品进行弯曲杆菌的分离鉴定,采用纸片扩散法测定分离菌株对8类10种抗菌药物的耐药性,采用PCR及测序技术检测菌株携带重要耐药基因的情况。结果表明:共分离到34株空肠弯曲杆菌和66株结肠弯曲杆菌,阳性率分别为13.5%和26.2%。鸡肉、鸭肉、鸽肉样品中弯曲杆菌阳性率分别为41.4%、29.6%和38.2%。耐药性检测结果显示,弯曲杆菌对四环素、红霉素、阿奇霉素、妥布霉素、氨苄西林和庆大霉素耐药率分别为60.0%、54.0%、54.0%、52.0%、50.0%和41.0%,对氟苯尼考和磷霉素耐药率分别为13.0%和2.0%,结肠弯曲杆菌的多重耐药率(84.8%)显著高于空肠弯曲杆菌(26.5%)。分离菌株对10种抗生素共产生31种耐药谱,空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的优势耐药谱分别为AMP-CN-TOB-CIP-TE和TOB-E-AZM-SXT-TE。aadE-sat4-aphA-3及RE-cmeABC检出率分别为26.0%和20.0%,其与弯曲杆菌多重耐药表型符合率分别为90.9%和83.3%。这一研究提示,江苏市售禽肉中存在多重耐药弯曲杆菌及重要耐药基因的流行,对食品安全有潜在的威胁,应进一步加强禽肉中弯曲杆菌的监测和防控。

肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染状况及耐药性分析

目的了解江苏某肉鸡屠宰加工厂不同环节弯曲菌的污染状况及耐药现状。方法采集屠宰前肉鸡泄殖腔、不同环节鸡酮体以及环境等样品,运用无血弯曲杆菌选择性培养基(modified charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar,CCDA)平板法进行分离纯化,PCR鉴定后,采用K-B法测定6大类14种抗生素耐药情况。PCR检测弯曲菌Ⅰ型整合子、四环素耐药基因tet(O)、氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3以及弯曲菌gyrA基因第257位碱基的突变情况。结果细菌分离结果显示170份样品分离到124株弯曲菌(72.95%)。分离株对链霉素、妥布霉素、卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、红霉素和四环素耐药率为100%,多重耐药现象普遍,多重耐药率高达100%,其优势耐药谱主要为CTX-CRO-cDA-K-NOR-SAZM-CIP-TE-NA-E-LEV-ENR-TOB。分离株经PCR扩增未检测到Ⅰ型整合子,所有菌株在gyrA喹诺酮类耐药决定区发生了C-257-T点突变,tet(O)基因和aadE-sat4-aphA-3检出率分别为100%和90.23%。结论江苏某肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染及耐药情况比较严重,gyrA基因突变、tet(O)基因及aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇的携带,与弯曲菌对喹诺酮类、四环素类和氨基糖苷类耐药密切相关。

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45 min即可扩增出梯形条带。LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的灵敏度为54 CFU/mL。对11株细菌进行LAMP扩增,仅3株金黄色葡萄球菌得到阳性结果。应用该方法对240份鸡蛋样品进行检测,检测结果与国标方法相符合,12份蛋壳金黄色葡萄球菌检测阳性,蛋内容物均未检出。LAMP检测金黄色葡萄球菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中金黄色葡萄球菌的有效手段。

江苏部分地区鸡源与猪源弯曲菌耐药性分析与毒力基因检测

旨在了解江苏省部分地区鸡源与猪源弯曲菌的耐药及毒力基因携带情况。从江苏省25个规模养殖场采集250份粪便样品进行弯曲菌的分离鉴定,采用琼脂平板稀释法测定9种抗菌药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MICs),PCR方法扩增弯曲菌8种与致病力相关的毒力基因。结果显示:共分离得到93株弯曲菌,包括空肠弯曲菌45株,结肠弯曲菌48株;空肠弯曲菌对萘啶酸(80.0%)、四环素(71.1%)和环丙沙星(66.7%)的耐药率较高,而结肠弯曲菌对红霉素(87.5%)、萘啶酸(79.2%)和阿奇霉素(72.9%)产生较强的耐药性,分离株多重耐药现象严重,多重耐药率达67.7%;8个毒力基因在弯曲菌分离株中的携带率不同,cdtB和cadF携带率为100%,htrB为97.8%,clpP为76.3%,csrA为18.3%,wlaN为5.4%,cstⅡ为2.2%,cgtB为0%。结果提示,江苏省畜禽养殖场弯曲菌分离株多重耐药情况严重,毒力相关基因在弯曲菌中分布广泛。

检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法的建立及初步应用

根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。

IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。

3种分子生物学方法检测金黄色葡萄球菌的比较研究

目的比较常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)对金黄色葡萄球菌的检测效果。方法以金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)标准菌株(ATCC6538)DNA为模板,以耐热核酸酶(Nuc)基因为靶标,采用常规PCR、qPCR和LAMP对其进行扩增并比较其检测灵敏度,同时对鸡蛋中金黄色葡萄球菌的检出率进行比较。结果常规PCR对S.aureus的检测灵敏度为400个基因拷贝数,低于实时荧光定量PCR和LAMP的40个基因拷贝数的检出限。在实际样品检测中常规PCR对50份鸡蛋外壳样品中S.aureus的检出率为6%,qPCR和LAMP的检出率分别为10%,而在鸡蛋内容物中均未检测到。结论 3种检测方法检测S.aureus均具有较高的灵敏度,但常规PCR的灵敏度低于qPCR和LAMP检测方法,qPCR需要昂贵的仪器,不适合基层现场应用,而LAMP方法简单、快捷,具有良好的应用前景。

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5′端和核酸探针3′端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法。结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2 fg,敏感性是常规PCR的10倍。对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL。对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60%和69%。

鸡源结肠弯曲菌耐药性分析

为了解江苏省鸡源结肠弯曲菌的流行情况和药物敏感性,对江苏省不同规模化养鸡场、农贸市场和超市的鸡泄殖腔样品和鸡肉产品进行结肠弯曲菌的分离及PCR鉴定;采用纸片扩散法测定分离株对17种抗菌药物的敏感性。结果显示,从750份样品(禽肉产品和泄殖腔棉拭子)中分离到81株结肠弯曲菌,分离率为10.8%。耐药性试验结果显示,80%以上菌株对头孢曲松、妥布霉素、诺氟沙星、环丙沙星、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶耐药,其中甲氧苄氨嘧啶耐药率达99%,对美罗培南和氟苯尼考保持高度敏感。所有测试菌株出现多重耐药,优势耐药谱为LIN/CRO/CN/T/NOR/CIP。调查结果为结肠弯曲菌防控提供参考依据。

空肠弯曲杆菌LAMP检测方法的建立及初步应用

目的建立一种灵敏的环介导等温扩增方法(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)用于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的快速检测。方法根据已公布的空肠弯曲杆菌旋转酶基因(gyrA)设计引物,建立并优化LAMP反应体系,对检测方法的特异性和灵敏度进行验证,并运用该方法对我国不同地方鸡种空肠弯曲杆菌的携带率进行调查。结果该方法能扩增出典型的梯形条带,且扩增产物的酶切鉴定结果与理论值相符;对单增李斯特菌等8株实验菌株进行检测,仅空肠弯曲杆菌的LAMP结果为阳性;该方法检测空肠弯曲杆菌纯培养物的灵敏度为20cfu/mL,高于常规PCR;不同地方鸡种空肠弯曲杆菌携带率介于6%～90%之间,差异显著。结论本试验建立的空肠弯曲杆菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高,有望在临床样品检测中发挥作用。

空肠弯曲杆菌感染对鸡胚肠上皮细胞TLR1和TLR15 mRNA转录水平的影响

研究以鸡胚肠上皮细胞为模型,采用相对荧光定量PCR技术检测空肠弯曲杆菌感染对鸡胚肠上皮细胞Toll样受体(TLR)1和15 mRNA转录水平的影响,探讨TLR1和TLR15在抵抗空肠弯曲杆菌感染中的作用及其机制。结果显示:正常的鸡胚肠上皮细胞能检测到TLR1和TLR15 mRNA的转录;空肠弯曲杆菌感染细胞后,TLR1在3 h后转录水平提高,12 h达到高峰;TLR15在感染后6 h转录水平达到高峰,至12 h略有下降;在整个试验周期感染组TLR1和TLR15 mRNA转录水平都极显著高于对照组(P<0.01)。以上研究表明TLR1和TLR15与肠上皮细胞抗空肠弯曲杆菌感染免疫反应具有相关性,TLR在细胞中的表达使得该细胞有能力抵御外界多种病原微生物的入侵。

老年营养风险指数在行放射治疗高龄食管癌患者预后评估中的价值

目的探讨老年营养风险指数(GNRI)对行放射治疗的高龄食管癌患者临床预后的影响。方法回顾性分析2012年1月~2016年12月在浙江省金华市中心医院行根治性放疗的70例老年(年龄≥70岁)食管癌患者的临床资料及生存资料。根据患者GNRI,将其分为低营养风险组(GNRI≥92)和高营养风险组(GNRI<92),比较两组患者一般资料、近期效果和1、2年生存率。结果两组患者血红蛋白、C反应蛋白比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。低营养风险组1、2年生存率显著高于高营养风险组,差异有统计学意义(P<0.05),高GNRI与患者较好的临床预后明显相关。多因素分析提示GNRI、TNM分期、同步化疗与近期效果是影响预后的独立因素(P<0.05)。结论高GNRI提示患者预后较好,老年营养风险指数是行根治性放疗的老年食管癌的独立预后指标。

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。

IBV S1基因和IL-2基因双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究

为了研制更加有效的IBV DNA疫苗,将IBV的S1基因和禽白介素2(IL-2)基因插入双顺反子表达载体pIRES-EGFP/DsRed中,构建能分别或同时表达S1基因和IL-2基因的pIRES-S1、pIRES-IL2、pIRES-S1/IL-2质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,二免后两周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果表明,pIRES-S1/IL-2在体外能够诱导Vero细胞表达S1蛋白和IL-2;pIRES-S1/IL-2和pIRES-S1+pIRES-IL2免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强IBV DNA疫苗对同型强毒的攻击保护,但pIRES-S1/IL-2免疫组要优于pIRES-S1+pIRES-IL2混合免疫组及其它对照组,差异显著或极显著。以上结果表明禽IL-2能同时加强DNA疫苗的细胞免疫和体液免疫应答;但抗原基因和IL-2共表达DNA疫苗的免疫效果明显要优于混合注射的DNA疫苗。

鸡胚肠上皮细胞Toll样受体的表达谱研究

为明确鸡胚肠上皮细胞中Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)的表达情况,本研究采用嗜热菌蛋白酶分离培养18日龄鸡胚的肠上皮细胞,在形态学观察及免疫细胞化学法鉴定基础上,采用RT-PCR方法检测其TLR表达谱,并对不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱进行了比较研究。结果表明,应用嗜热菌蛋白酶消化法得到的鸡胚肠上皮细胞生长状况良好;采用低速离心和差速贴壁进行纯化,得到90%以上纯度的鸡胚肠上皮细胞;纯化后的细胞经形态学观察及细胞角蛋白单克隆抗体鉴定为阳性;10种TLR在鸡胚肠上皮细胞上均有mRNA表达,但其丰度存在明显差异;不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱均无显著差异。

空肠弯曲杆菌ERIC-PCR分型技术研究

目的建立空肠弯曲杆菌肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)的分子分型技术,快速分析空肠弯曲杆菌指纹谱。方法本研究提取空肠弯曲杆菌ATCC33560的基因组DNA作为模板,采用对优化项目设置梯度其它条件不变的方法,对ERIC-PCR反应中的模板量、引物浓度和退火温度等进行优化,建立空肠弯曲杆菌的ERIC-PCR分型技术,并采用该技术对20株空肠弯曲杆菌的指纹图谱进行了分析。结果 ERIC-PCR反应体系中DNA模板量96ng/25μL,ERIC1、ERIC2引物浓度各0.8μmol/L,退火温度40℃时,指纹图谱条带清晰、明亮;20株空肠弯曲杆菌临床分离株ERIC-PCR指纹图谱差异较大,可在160bp^32000bp范围内出现2条~13条条带,分为14型。结论研究显示成功建立了空肠弯曲杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型技术,应用该方法可从分子水平上对空肠弯曲杆菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,具有简便和快速等优点,能够为空肠弯曲杆菌流行病学调查提供科学依据。

鼻咽癌患者血清中TK1的检测意义

目的探讨血清细胞质胸苷激酶1(TK1)在鼻咽癌患者的诊断及治疗后效果评估中的意义。方法应用免疫印迹增强化学发光法检测30例对照组(包括15例鼻咽部炎症患者和15例正常体检者)和30例初治鼻咽癌患者治疗前及治疗后的血清中TK1浓度,分析治疗前后鼻咽癌患者TK1水平变化。结果鼻咽癌患者治疗前血清TK1水平明显高于健康对照组,TK1水平与鼻咽癌分期有明显相关性,而与淋巴结是否转移无明显相关性;鼻咽癌患者治疗后TK1水平明显低于治疗前。结论血清TK1检测对鼻咽癌患者的临床诊断及疗效评价具有一定的临床应用价值。

几丁质酶在农业方面的应用研究概况

目前,合成类杀虫剂和杀真菌剂的滥用造成了严重的环境污染。而几丁质酶有潜在的抗含几丁质的病原体的特性,因此在农业方面应用前景广泛。综述了在几丁质酶抗植物病原真菌、杀虫、抗细菌和果蔬采后病害的防治等方面的应用研究情况。在此基础上,对几丁质酶在生物农业上的应用前景进行了展望。