与肝癌细胞系HepG2特异性结合单链抗体的筛选与序列分析

目的从人源噬菌体抗体库中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,为寻找肝癌细胞表面特异性标志及靶向研究奠定基础。方法以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞,以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞,从人源噬菌体抗体库(Griffin.1Library)经三轮筛选后,阳性菌质粒PCR确定其中含有单链抗体基因的克隆,通过细胞ELISA及FCM筛选特异性的单链抗体噬菌体,通过ABI3730全自动荧光测序仪测序,并通过GeneBank比对进行同源性分析,IPTG诱导可溶性单链抗体表达,并检测其与肝癌细胞株结合的特异性。结果获得了2个特异性较高的阳性噬菌体单个克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,并用IMGTVQuest软件进行分析,确定为2个插入序列不同的单链抗体片段。经细胞ELISA证明其阳性克隆菌培养上清可与肝癌细胞株特异性结合。获得的序列成功登陆Genebank,序列号为AY686498AY686499。结论从人源噬菌体抗体库中筛选到与肝癌细胞系HepG2特异性结合的具有功能活性的单链抗体,为进一步寻找肝癌细胞表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。

HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达

目的:构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,并诱导表达。方法:提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒,用SfiI、NotI分别酶切,连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上,转化和筛选后,阳性细菌经IPTG诱导表达,细胞ELISA鉴定融合蛋白活性。结果:重组质粒经PCR扩增,Eco91Ⅰ单酶切及Eco91Ⅰ/NotI双酶切鉴定,证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上。表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔,细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性。结论:成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,为其应用奠定了基础。

肝癌细胞特异性结合单链抗体三维结构的同源模建

用MSI公司开发的计算机辅助分子设计系统模建肝癌细胞表面抗原特异性单链抗体三维结构。先分别模建VH(variable region of the heave chain)和VL(variable region of the light chain)两个结构域,然后搭建出scFv(single chain variable fragment)片段的整体三维结构,并对模建的结构进行分子力学和动力学优化;对结构的合理性验证显示模建结构是合理的。文章可为预测该特异性单链抗体的生物活性以及研制高亲和力、高特异性的双价抗体提供结构信息。