ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。

乳糖诱导角质细胞生长因子-2在大肠杆菌中的表达

目的:研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行角质细胞生长因子-2(KGF-2)基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。方法:分别比较乳糖诱导浓度、诱导时机、诱导时间及诱导温度对重组表达产物的影响,并以IPTG诱导作为对照,确定较为优化的乳糖诱导条件。结果:对于重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到良好效果,以乳糖为诱导剂的A600值较IPTG高,诱导产物的表达量与IPTG诱导产物相当。以终浓度为10g.L-1乳糖在33℃下诱导6h,可以达到良好的诱导效果,并且具有较好的可溶性和促细胞生长活性。结论:乳糖可替代IPTG诱导角质细胞生长因子基因表达,并取得良好效果,为工程化生产提供了良好的实验依据。

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆、表达及活性

从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,利用RT-PCR法获得人角质细胞生长因子-2(hKGF-2)cDNA,并通过PCR方法扩增,再与原核表达载体pET3c连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中获得表达菌株.通过流加补料方式和发酵条件的控制,进行高密度培养,并通过IPTG诱导获得可溶性表达的目的产物.结果表明:目的蛋白占菌体总蛋白的30.0%以上;经阳离子交换层析、肝素亲和层析两步柱层析方法获得的rhKGF-2纯度高于99.0%.建立了利用转受体FGFR2-Ⅲb的BaF3细胞株进行rhKGF-2促增殖作用的活性测定方法,活性测定结果呈典型的S型曲线,并在一定范围内具有剂量依赖性.

不同物理和化学因素对重组人角质细胞生长因子2稳定性的影响

目的:研究重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同保存条件下的稳定性,阐明温度、pH值、缓冲溶液及反复冻融因素对rhKGF-2稳定性的影响作用。方法:rhKGF-2在不同温度(-20℃、4℃、25℃、40℃)、pH值(pH4～9)、缓冲溶液(柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、吉斐氏缓冲溶液)及反复冻融条件下分别保存,采用RP-HPLC法检测rhKGF-2纯度,同时观察外观性状。结果:-20℃、4℃分别保存时,rhKGF-2的各项性质在观察期内都无明显变化;25℃时,rhKGF-2存放28d纯度较0h(100.00%)下降至(68.20±0.14)%;40℃时,rhKGF-2存放9h纯度较0h(100.00%)下降至(4.80±0.39)%。rhKGF-2(pH6.0)在25℃条件下保存90d纯度较0h(100.00%)下降至(79.20±0.12)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.05);pH值为4.0、9.0的rhKGF-2液体在25℃条件下分别保存120h纯度较0h(100.00%)下降至(15.60±0.30)%和(67.30±0.10)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2在柠檬酸缓冲液中25℃条件下保存60d纯度较0h(100.00%)下降至(79.20±0.15)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2原液反复冻融后其纯度变化差异无显著性(P>0.05)。结论:rhKGF-2在低温和pH6.0～7.0中性条件下稳定。高温、偏酸性和偏碱性条件下均不利于rhKGF-2稳定。柠檬酸缓冲液有利于rhKGF-2稳定。反复冻融对rhKGF-2稳定性影响不明显。

成纤维细胞生长因子-21改善胰岛素抵抗肝细胞对葡萄糖的吸收及机制

目的建立正常人肝细胞(HL-7702)胰岛素抵抗(in-sulin resistance,IR)模型,探讨成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)对胰岛素抵抗的改善作用及其机制。方法培养HL-7702细胞,利用高浓度胰岛素和地塞米松(dexametha-sone,DEX)诱导IR模型。GOD-POD试剂盒测定细胞葡萄糖消耗量,Western blot检测GLUT1和磷酸化ERK1/2表达水平。结果 FGF-21促进HL-7702细胞葡萄糖的消耗且呈剂量依赖性,与胰岛素联合用药提高葡萄糖消耗量。在随后IR模型实验中,FGF-21改善IR模型细胞葡萄糖消耗量。FGF-21作用24 h,GLUT1的表达量明显增高,p-ERK1/2的含量增强。当加入ERK1/2特异性抑制剂PD98059,FGF-21促ERK1/2的磷酸化作用被抑制。IR模型中,FGF-21仍能提高p-ERK1/2的含量。结论 FGF-21促进HL-7702细胞对葡萄糖的消耗,改善IR HL-7702细胞葡萄糖消耗量,提高葡萄糖转运蛋白GLUT1和ERK1/2磷酸化的表达。

重组人成纤维细胞生长因子21降糖作用研究

目的利用肝细胞、肌肉细胞,前脂肪细胞及ob/ob小鼠进行rhFGF21体内外降糖作用研究。方法培养人正常肝细胞(HL-7702),大鼠肌肉细胞(L-6),小鼠前脂肪细胞(3T3-L1),用GOD-POD试剂盒测定细胞葡萄糖吸收量;FGF-21按照每天0.6μg·g-1的剂量颈部皮下连续注射7d,分别在d 0、d 3、d 7给药后1 h检测空腹血糖,以生理盐水做对比;rhFGF-21按照每天0.6μg·g-1的剂量颈部皮下连续注射9 d,末次给药后1 h开始口服糖耐量实验,灌胃给予2 mg.g-1的葡萄糖溶液,分别于给予葡萄糖溶液后30、60、120 min检测血糖;rhFGF-21按照每天2.5μg·g-1的剂量颈部皮下注射连续7 d,在d 0、d 3、d 7给药后1 h检测餐后血糖。结果在3.9 mg·L-1～100 mg·L-1间rhFGF21促进HL-7702细胞葡萄糖的吸收且呈现浓度-效应关系,与对照组相比差异有显著性(P<0.01);在0.3 mg·L-1～250 mg·L-1间rhFGF21促进L6肌细胞对葡萄糖的吸收,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);在12.6 mg·L-1～100 mg·L-1间rhFGF21促进分化的3T3-L1细胞葡萄糖的吸收且呈现浓度-效应关系,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);ob/ob小鼠血糖测试证明,rhFGF-21具有降血糖和改善葡萄糖耐受量的作用。结论 rhFGF21体外可促进肝细胞、肌肉细胞及脂肪细胞葡萄糖的吸收;rhFGF-21可降低ob/ob小鼠空腹血糖及餐后血糖,具有改善其葡萄糖耐受量的作用。

成纤维细胞生长因子20单克隆抗体的制备及鉴定

构建表达重组人成纤维细胞生长因子20(fibroblast growth factor 20,FGF20)原核表达载体,并制备抗FGF20单克隆抗体,为开发新的药物奠定基础。构建pET24a-SUMO-hFGF20原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。经镍NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,SUMO酶酶切后,再次经镍NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE法检测目的蛋白纯度。以重组FGF20蛋白免疫Balb/c小鼠,常规方法制备FGF20单克隆抗体,采用protein G柱分离纯化,SDS-PAGE法检测抗体纯度,ELISA法检测抗体效价和亚型,Western blot和SPR法测定抗体亲和力。成功构建pET24a-SUMO-hFGF20重组质粒。经分离纯化后获得FGF20蛋白相对分子质量为23 kD。得到1株ELISA检测强阳性杂交瘤细胞株,单克隆抗体纯化后,效价为1:25600,亚型为IgG1,可以与商品化抗原结合,亲和力为1.07×10^(-7)mol/L。通过构建、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗FGF20蛋白高亲和力单克隆抗体。

绿头鸭育成期的饲养管理

育成期主要是指从育雏期结束（15d）到84日龄屠宰上市这段时间。据其生长规律，可将此期分为3个阶段，即：生长前期（16-35d）、生长后期（36-70d），维持期（71-84d）。育成期每只商品鸭大约耗料7-7.5kg。1、生长前期 此期是绿头鸭体重增长的关键时期，该期饲养管理的好坏直接影响终产的生产成绩。春末夏初，雏鸭由育雏室转入育成舍后，

上海公路隧道监控系统中PLC控制策略发展的研究

公路监控系统中最复杂和典型的当属隧道监控系统,PLC的应用发展一直以来都扮演着整个隧道监控核心系统的角色。上海公路隧道监控系统中PLC的控制策略经过了几个阶段对各种问题的不断改良提升,从一开始的全分布式控制策略到最成熟的弱主控控制策略,发现最稳定的控制系统往往是结构最简单的。就上海公路隧道监控系统中PLC控制策略发展的几个阶段进行相应的描述,并解析其策略特点。

重组人角质化细胞生长因子-2发酵条件的优化及其活性

目的优化重组人角质化细胞生长因子-2(Recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)基因工程菌的发酵条件,并对rhKGF-2进行纯化及活性检测。方法优化rhKGF-2基因工程菌接种量、装液量、培养基初始pH值、IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等发酵条件;rhKGF-2经离子交换层析和肝素亲和层析后,采用MTT法检测其对NIH-3T3细胞增殖的影响。结果 rhKGF-2基因工程菌的最佳发酵条件为:接种量2.0%,装液量50ml/250ml三角瓶,培养基初始pH值6.5～7.0,IPTG浓度0.10mmol/L,菌体处于对数生长初期时(A600=0.8～1.0)开始诱导,诱导时间4h;纯化的rhKGF-2经HPLC检测纯度达95.0%以上;在1～100μg/ml浓度范围内,rhKGF-2对NIH-3T3细胞的增殖具有促进作用。结论优化了rhKGF-2基因工程菌的发酵条件,获得了纯度较高、具有活性的rhKGF-2蛋白,为其工业化生产奠定了基础。

用QQ经营粥铺

一名小伙了在全国首先使用QQ经营粥铺，居然一夜间迅速改变命运，让深陷绝境的小店起死回生！广州偷师学艺开粥铺 陈晨今年28岁，是浙江省温州市鹿城区人。他看到广东粥铺的生意十分红火，也想在温州开家粥铺。为了掌握煲粥的诀窍，2002年秋。他前往广州学艺。他应聘到一家粥铺打杂，边工作边默记煲粥的操作要领。偷师学艺一年后，2003年9月4日，陈晨在温州市最繁华的商业中心时代广场附近，以3000元月租，租了一间门面经营了“财神记”粥店。粥铺开张头一天，居然只卖出了十几碗粥。