代谢重编程:单核/巨噬细胞训练免疫参与动脉粥样硬化的新机制

动脉粥样硬化是血管的慢性炎症性疾病,单核/巨噬细胞的异常活化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。近期研究发现单核/巨噬细胞可以通过训练免疫发生代谢重编程,促进炎症反应,加快动脉粥样硬化的进展,并可以导致心血管意外事件的发生。文章综述了单核/巨噬细胞代谢重编程在训练免疫发生中的作用和机制,可能为动脉粥样硬化的防治提供新的治疗靶点和方法。

PI3K/AKT通过激活糖酵解促进巨噬细胞M1极化

目的探讨PI3K/AKT通路在巨噬细胞糖酵解中的作用,拟从代谢重编程的角度阐明巨噬细胞M1极化的机制。方法以脂多糖(LPS)处理RAW264.7细胞建立巨噬细胞M1极化模型;使用2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解过程;使用LY294002抑制PI3K/AKT活性;Seahorse XF糖酵解速率试剂盒检测巨噬细胞糖酵解水平;q-PCR方法检测巨噬细胞M1型标记(诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β),葡萄糖酵解相关基因(Glut1、HK2、Idha和Aldoa);Western blot方法检测p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-p65、p65、IκB、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和GAPDH水平。结果在LPS诱导的RAW264.7细胞M1极化模型中,p-mTOR和p-AKT水平升高,HIF-1α表达水平升高,糖酵解相关基因水平升高,细胞外酸化率升高,表明LPS诱导细胞糖酵解水平升高;2-DG抑制糖酵解,降低M1极化相关因子的mRNA水平;LY294002抑制PI3K/AKT活性,降低p-mTOR水平和HIF-1α的蛋白水平,降低糖酵解相关基因水平,进而抑制RAW264.7糖酵解水平和M1极化过程。结论在RAW264.7细胞中PI3K/AKT信号通路通过激活mTOR信号通路,激活糖酵解,从而激活巨噬细胞M1极化过程。

游离脂肪酸抑制AMPK信号通路促进小鼠巨噬细胞葡萄糖酵解和M1极化

[目的]探讨游离脂肪酸对小鼠巨噬细胞葡萄糖酵解和M1极化的影响,从巨噬细胞代谢重编程和M1极化阐明非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病机制,为NASH的防治提供新的思路。[方法]以油酸/棕榈酸(O/P)处理RAW264.7细胞建立游离脂肪酸处理巨噬细胞模型;转染AMP活化蛋白激酶(AMPK)特异siRNA抑制AMPK表达;使用阿卡地新(AICAR)激活AMPK活性。采用qPCR检测巨噬细胞M1型分子标志物(TNF-α、IL-6和MCP-1)、M2型分子标志物(CD206和IL-10)以及葡萄糖酵解相关基因(PGM1、PGK1、GPI1、LDHA、ALDOA、GLUT1和HK2)mRNA水平,采用Western blot检测p-mTOR/mTOR、p-Raptor/Raptor、p-Akt/Akt、p-AMPK和AMPK蛋白水平。[结果] O/P处理RAW264.7细胞后,p-mTOR/mTOR和p-Akt/Akt蛋白水平升高(P<0.05),p-Raptor/Raptor、p-AMPK和AMPK蛋白水平降低(P<0.05),葡萄糖酵解相关基因PGM1、PGK1、GPI1、LDHA、ALDOA、GLUT1和HK2 mRNA水平升高(P<0.05),促炎因子TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA水平升高(P<0.05),抑炎因子CD206和IL-10 mRNA水平降低(P<0.05)。抑制RAW264.7细胞中AMPK表达后,p-mTOR/mTOR和p-Akt/Akt蛋白水平升高(P<0.05),p-Raptor/Raptor、p-AMPK和AMPK蛋白水平降低(P<0.05),葡萄糖酵解相关基因PGM1、PGK1、GPI1、LDHA、ALDOA、GLUT1和HK2 mRNA水平升高,促炎因子TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA水平升高(P<0.05),抑炎因子CD206和IL-10 mRNA水平降低(P<0.05)。激活AMPK活性可逆转O/P对巨噬细胞葡萄糖酵解和M1极化的影响。[结论]在RAW264.7细胞中游离脂肪酸通过抑制AMPK信号通路促进葡萄糖酵解和M1型极化。

胆固醇诱导血管内皮细胞基因的差异表达

为探讨高胆固醇致动脉粥样硬化的分子机理 ,利用抑制消减杂交技术克隆胆固醇诱导脐静脉内皮细胞产生的差异表达基因 ,并对其表达进行初步研究。经顺、反两向消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得了差异表达的cDNA片段 ,克隆化后挑选部分进行测序、同源性比较及应用半定量逆转录—聚合酶链反应分析部分差异基因的表达情况 ,得到 2 3个差异表达的cDNA片段 ,其中 6个新差异表达cDNA片段被GenBank接受。已知基因中的血小板反应蛋白

野生型P53基因导入诱导血管平滑肌细胞凋亡

为观察野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的现象，探讨对生型P53基因导入抑制平滑肌细胞增殖的作用机理，构建了野生型P53基因的重组腺病毒载体，体外转染兔主动脉血管平滑肌细胞。应用流式细胞议分析细胞周期，氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入试验检测DNA合成，琼脂糖凝胶电泳观察DNA区带图谱，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术原位检测细胞凋亡。结果发现，野生型P53基因重组腺病毒载体转梁平滑肌细胞后，细胞内DNA合成减少。流式细胞仪分析显示77％的平滑肌细胞生长停滞在G0／Gl期，约45％的细胞发生细胞凋亡。dUTP切口末端标记阳性细胞百分率为40％～50％。DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现阶梯状区带图谱。以上结果提示，野生型P53基因通过诱导细胞凋亡对血管平滑肌细胞增殖起抑制作用。

ω-3多不饱和脂肪酸对HepG2细胞胆固醇代谢的影响

目的胆固醇是维持哺乳动物细胞存活及功能所不可缺少的成分,然而高水平的血清胆固醇是动脉硬化性心血管疾病的独立危险因素。体内胆固醇代谢的平衡取决于以下三个主要代谢途径:体内胆固醇的合成、小肠对胆固醇的吸收以及胆汁/粪便胆固醇的分泌等。因此,降低体内胆固醇的合成,减少胆固醇的吸收,以及增加胆固醇的分泌都是降低体内胆固醇水平的有效手段。已有研究报道ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFA)可以增加小鼠巨噬细胞胆固醇的流出而促进胆固醇的逆向转运。但ω-3 PUFA对肝细胞胆固醇代谢的影响至今未见报道。本研究旨在探讨ω-3 PUFA在肝细胞胆固醇合成和分泌中的作用。方法应用50μmol/Lω-3 PUFA(DHA或EPA)处理人肝癌细胞系HepG2 48 h后,收集细胞,用甲醇/氯仿(2∶1)溶液抽提细胞总脂质,在表面活性剂TritonX-100的作用下将脂质溶解于蒸馏水中,并用酶法测定细胞胆固醇浓度;提取细胞总蛋白,用Western blot检测与胆固醇合成相关基因SREBP2和HMG-CoA还原酶,胆固醇向胆酸转化的限速酶CYP7a1,以胆固醇分泌相关基因ABCG8的蛋白表达情况。结果经50μmol/LDHA或EPA处理HepG2细胞48 h后,细胞胆固醇水平显著降低,细胞CYP7a1和ABCG8的蛋白水平显著升高,而SREBP2和HMG-CoA还原酶的蛋白表达水平未见明显变化。结论ω-3 PUFA可以通过提高HepG2细胞胆酸的形成和分泌以及游离胆固醇的分泌而降低细胞内胆固醇浓度。

Niemann-Pick C1-Like 1表达缺陷缓解肝X受体激动剂诱导的小鼠肝脏脂肪性变

目的探讨Niemann-Pick C1-Like 1在肝X受体激动剂诱导的肝脏脂肪性变中的作用。方法给C57BL/6小鼠和Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠喂食0.015%胆固醇饮食21天,胃饲溶剂或肝X受体激动剂T0901317一周后,收集小鼠肝脏,称重;抽提肝脏脂质并用酶法检测脂质含量;用实时定量聚合酶链反应法检测肝脏表达与脂肪合成相关基因固醇调节元件结合蛋白1c、脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1的mRNA水平。结果在胃饲T0901317一周后,C57BL/6小鼠肝脏由1.1±0.1g增大到2.8±0.3g,肝脏甘油三酯含量由34.2±18.1mg/g增至232.2±67.9mg/g,固醇调节元件结合蛋白1c、脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1mRNA水平在肝脏的表达也显著增高;而Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠肝脏由0.9±0.1g增大到1.5±0.1g,肝脏甘油三酯含量由43.7±26.5mg/g增至104.9±62.1mg/g,脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA去饱和酶1mRNA水平在肝脏的表达也显著增高。但在T0901317诱导下,Niemann-Pick C1-Like 1基因敲除小鼠肝脏脂肪酸合成酶mRNA水平仍比C57BL/6小鼠低63%。结论Niemann-Pick C1-Like 1表达缺陷降低肝X受体激动剂诱导的肝脏固醇调节元件结合蛋白1c和脂肪酸合成酶的表达,缓解小鼠肝脏脂肪性变。

野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞P21基因表达

为研究野生型P53基因导入诱导血管平滑肌细胞P21基因的表达，探讨P53基因调节细胞周期进程的作用机理，体外培养了人脐动脉平滑肌细胞。将野生型P53基因导入细胞后，应用逆转录－聚合酶链反应半定量测定P21mRNA水平，以免疫组织化学法观察P21蛋白表达的变化，并用流式细胞术分析细胞周期。结果发现，正常生长的血管平滑肌细胞中P21mRNA水平较低，用免疫组织化学法检测不到P21蛋白。野生型P53基因导入并在平滑肌细胞中表达后，显著增加了P21mRNA水平，在免疫组织化学检测中呈现很强的阳性显色反应、引起平滑肌细胞停滞在G0／G1期。以上结果提示，野生型P53基因通过诱导P21基因表达调控血管平滑肌细胞周期。

氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞凋亡的机理研究

To investigate the mechanism involved in the apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by oxidized low density lipoprotein(OX LDL),cultured human vascular smooth muscle cells derived from umbilical artery were exposed to OX LDL.The apoptotic cells were determined by deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).The gene expressions of p53,p21,c fos and c jun were quantified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT PCR).The contents of p53,p21,c fos and c jun were analyzed by immunochemical staining.The apoptotic vascular smooth muscle cells were found following treatment with OX LDL.The levels of p53,p21,c fos mRNA and protein were increased in vascular smooth muscle cells exposed to OX LDL.However,c jun expression remained constant.These results indicated that OX LDL could upregulate the expression of p53,p21 and c fos,inducing the apoptosis in vascular smooth muscle cells.

肝脏表达的Niemann-Pick C1-Like 1调节小鼠的胆汁胆固醇浓度

目的:探讨人(NPC1L1)在小鼠肝脏的过表达对胆汁胆固醇重吸收的影响。方法:通过杂交NPC1L1基因敲除小鼠(L1-KO)与肝脏过表达人的NPC1L1的转基因小鼠(L1-Tg),获得无小鼠自身NPC1L1基因表达、在肝脏过表达或不表达人NPC1L1基因的小鼠(L1-Tgliv+和L1-Tgliv-)。给予L1-Tgliv+小鼠(实验组)及L1-Tgliv-小鼠(对照组)含0.2%胆固醇的饮食并测定2组小鼠胆汁的脂质分泌、血浆的脂质水平和粪便核心固醇的分泌。结果:与L1-Tgliv-小鼠相比,L1-Tgliv+小鼠的胆汁胆固醇水平降低了90%,同时粪便核心固醇的分泌也降低了10%,而血浆总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯水平分别升高了38.6%、47.6%和36.6%。结论:小鼠肝脏NPC1L1的过表达可提高肝脏对胆汁中胆固醇的重吸收。

人单核细胞泡沫化敏感候选基因的筛选

为克隆调控单核细胞源性泡沫细胞形成的相关基因 ,采用抑制消减杂交法筛选U937细胞经氧化型低密度脂蛋白温育形成泡沫细胞后差异表达的基因。经过正向、反向两轮消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得了富集的差异表达的cDNA片段 ,即表达序列标签 ,克隆化后挑选经鉴定含有插入片段的质粒测序。经Genbank数据库进行同源比较 ,获得 2 0余个差异表达的EST ,其中 2个克隆FRG4和FRG1 4只有片段同源序列而无全长同源序列 ,提示可能来自新基因。Genbank登录号为 :FRG4(BI 50 2 586)和FRG1 4 (BI 50 2 587)。

北京部分职业人群血清非高密度脂蛋白胆固醇参考值及其分布

非高密度脂蛋白胆固醇代表除高密度脂蛋白胆固醇以外一切有致动脉粥样硬化作用的脂蛋白 (以胆固醇含量表示 )的总和 ,用总胆固醇减去高密度脂蛋白胆固醇即可算出。为了解北京部分职业人群非高密度脂蛋白胆固醇的参考值及其分布 ,选择调查 2 0 0 0～ 2 0 0 1年来院体检的北京市事业及企业单位干部与职工 (不包括体力劳动者 ) ,共计 2 816 1人 (男 女为 6 4 ) ,年龄 2 0～ 85岁。按标准化要求空腹测定总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯水平 ,以Freidewald公式计算低密度脂蛋白胆固醇水平。结果发现 ,非高密度脂蛋白胆固醇随年龄上升 ,5 0岁以下男性高于女性 ,5 0岁以上女性高于男性。非高密度脂蛋白胆固醇年龄标化均值男为 3.4 7mmol L、女为 3.2 9mmol L ,但老年男为 3.90mmol L、老年女高达 4 .2 1mmol L。假定甘油三酯在临界值 (1.7mmol L)时 ,非高密度脂蛋白胆固醇比低密度脂蛋白胆固醇高 0 .77mmol L ,由于该组人群甘油三酯水平较低 ,各年龄组两项指标的差距都或多或少地低于 0 .77mmol L。调查所得非高密度脂蛋白胆固醇水平比美国全国有代表性的数据大约低 2 0 % (男女相近 ) ,以上表明北京部分职业人群动脉粥样硬化性心血管病危险明显低于美国人。

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与动脉粥样硬化

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是一种多亚单位酶复合体,是细胞中一种可诱发的电子传递系统。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体,它的激活受蛋白激酶C等信号途径介导。研究表明NADPH氧化酶和近年来新发现的gp91phox同工酶即NOX蛋白家族可能通过损伤血管内皮、促进低密度脂蛋白氧化等参与动脉粥样硬化的发生和发展。

雌激素硫酸转移酶和BIN1蛋白在乳腺癌组织中的基因表达及其意义

背景与目的:雌激素硫酸转移酶(estrogensulfotransferase,EST)是硫酸化代谢雌激素(使雌激素活性降低)的主要酶,BIN1蛋白(bridgingintegratorprotein-1)是一种新发现的具有抑癌特性的c-myc连接蛋白,两者可能在肿瘤发生中起保护作用。本研究检测EST和BIN1基因表达在乳腺癌组织中的改变,探索乳腺癌的发病机制。方法:逆转录多聚酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)方法检测ESTmRNA和BIN1mRNA在人正常乳腺和乳腺癌组织中的表达。结果:ESTmRNA和BIN1mRNA在正常乳腺组织中全部表达,而ESTmRNA在75%乳腺癌组织中表达降低,25%中表达缺失;BIN1在25%乳腺癌组织中表达降低,66.7%中表达缺失。结论:ESTmRNA和BIN1mRNA表达降低或缺失,可能是乳腺癌变的分子机制之一。

1981～2001年北京市职业人群血清总胆固醇水平的变动

分析 1981年至 2 0 0 1年 2 0年间北京市部分职业人群血清总胆固醇水平的变化。在力求做到血脂测定标准化的基础上 ,回顾性分析 2 0年来北京市部分机关和企事业单位工作人员 47434人次总胆固醇水平的变化 ,按年度、性别、年龄分组统计。结果发现 ,总胆固醇水平从 1981年至 1988年间上升幅度较大 ,年龄调整均值男性上升0 .73mmol/L (2 8mg/dL) ,女性上升 0 .6 2mmol/L (2 4mg/dL)。至 1990年已达最高值 ,2 0 0 1年低于 1991年 ,男、女年龄调整均值分别回落 0 .2 1mmol/L (8mg/dL)及 0 .2 3mmol/L (9mg/dL)。男女总胆固醇水平随年龄上升 ,从青年至老年 ,男性上升约 2 0 %,而女性升高达 35 %,上升趋势基本一致。不同年龄组间上升幅度有明显的男女差异 ,青年期男性大于女性 ,中年以后女性上升幅度增大 ,从 40～ 49岁至 5 0～ 5 9岁组男性平均上升 3%,而女性上升达 14%,6 0岁以后上升很少。所以总胆固醇水平在 5 0岁以前男性高于女性 ,5 0岁以后女性高于男性。以 1985年、1991年和 2 0 0 1年为例 ,无论男女 ,年龄标化的高胆固醇检出率 [总胆固醇≥ 5 .17mmol/L (2 0 0mg/dL)、≥ 5 .6 9mmol/L (2 2 0mg/dL)及≥ 6 .0 2mmol/L (2 40mg/dL) ]1991年比 1985年明显增高 ,而 2 0 0 1年与

β淀粉样蛋白25-35致神经细胞损伤的机制及信号转导通路初步研究

目的探讨β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)导致神经细胞损伤的机制及在损伤过程中涉及的信号转导通路中相关酶caspase-3的变化。方法采用荧光染色法、流式细胞法、反转录PCR法研究Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的损伤机制及信号转导通路中caspase-3的变化。结果经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞核中出现浓染的碎块状荧光,流式细胞法检测到凋亡特有的亚二倍体峰,对照组细胞凋亡率为(3.57±0.28)%(n=9),经10、20μmol/L Aβ25-35处理30 h的细胞,其凋亡率分别为(17.44±1.27)%和(38.82±2.06)%,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。反转录PCR产物凝胶电泳的caspase-3与看家基因-βactin的比(0.92)高于对照组(0.19)。结论Aβ25-35促使SH-SY5Y细胞凋亡,此过程中caspase-3转录水平增高。

野生型p53基因的导入对膀胱癌细胞抑制作用的观察

转染外源野生型ｐ５３基因对膀胱癌ＥＪ细胞的抑制作用。方法将含外源野生型ｐ５３基因的（ａｄ┐Ｗｔｐ５３）转染膀胱癌ＥＪ细胞，观察生长曲线，细胞周期变化及裸鼠体内抑瘤试验。结果转染了ａｄ┐Ｗｔｐ５３的ＥＪ细胞在体外生长速率下降，在裸鼠体内致瘤性丧失，流式细胞仪显示，ＤＮＡ合成前期或静止期的细胞比例增高。另外，ａｄ┐Ｗｔｐ５３直接注射到肿瘤组织内，可使外源野生型ｐ５３基因在肿瘤细胞内有效、稳定的表达，肿瘤表现为生长减缓，最后停止生长并有缩小。结论腺病毒载体介导基因转染效率高，速度快，安全，是很有前途的体内基因治疗载体。

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时泛素缀合酶和p53的表达

为研究氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡时泛素—蛋白酶体通路中泛素缀合酶、p5 3与泡沫细胞凋亡之间的关系 ,用氧化型低密度脂蛋白处理人单核细胞U937细胞 ,诱导其凋亡 ,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡 ,逆转录聚合酶链反应检测泛素缀合酶和p5 3的基因表达 ;流式细胞术分析泛素缀合酶、载脂蛋白B和P5 3的蛋白表达。结果发现 ,氧化型低密度脂蛋白可以诱导U937细胞凋亡 ,在U937细胞凋亡过程中泛素缀合酶表达降低 ,p5 3表达增高 ,而且细胞内载脂蛋白B也增加。结果提示 ,泛素缀合酶的表达降低可能使P5 3和载脂蛋白B经泛素—蛋白酶体通路的降解减慢 ,从而引起P5 3和载脂蛋白B在细胞内积聚 。