人可溶性DSG2胞外域蛋白的真核表达、纯化及活性鉴定

目的:构建DSG2与人IgG Fc片段融合的分泌型真核表达载体,在293T细胞中验证其表达,纯化具有生物活性的分泌型蛋白。方法:通过PCR扩增DSG2胞外域片段基因(DSG2 extracellular domain,DSG2ex),并将其整合到真核表达质粒pCMV3-IgG1中,构建重组真核表达质粒pCMV3-DSG2ex-IgG1。将构建成功的真核表达质粒转染入293T细胞中,使细胞外分泌表达DSG2胞外域蛋白,收集细胞上清液,经亲和层析Protein A纯化后,进行Western Blotting和ELISA活性鉴定。结果:成功构建了pCMV3-DSG2ex-IgG1真核表达质粒。转染后96 h蛋白表达量最高,表达产物纯化后经SDS-PAGE电泳分析其相对分子质量在100~130 kDa之间,与预期一致,纯化的融合蛋白纯度达90%以上,含量为0.8 mg/mL。通过Western Blot检测纯化后带有IgG1标签的DSG2胞外域蛋白能被IgG单克隆抗体识别。ELISA结果显示制备的DSG2胞外域蛋白具有明显结合人55型腺病毒(HAdV-55)Fiber Knob蛋白的活性,结论:成功建立了一种简单高效的人可溶性DSG2胞外域蛋白真核表达及纯化的方法,且纯化出来了具有生物活性的DSG2胞外域蛋白,为后期其蛋白功能研究及抗腺病毒药物的研究奠定了基础。

2006—2017年中国儿童肝癌的流行特征分析

目的分析2006—2017年中国儿童肝癌的流行病学特征,并探究儿童乙型肝炎流行与肝癌发病变化趋势间的相关性。方法以《中国肿瘤登记年报》中2006—2017年儿童肝癌的数据为主要资料,采用Joinpoint回归模型分析儿童肝癌发病的世界人口标化率变化趋势,并比较儿童肝癌的发病情况在不同地区、性别和年龄组间的分布;提取中国公共卫生科学数据中心的儿童乙肝发病资料研究乙肝流行的变化趋势,采用Pearson相关系数探究与肝癌发病变化趋势间的相关性。结果2006—2017年中国儿童肝癌的标化发病率以2010年为界,呈先下降后趋于稳定的趋势(AAPC=-5.09%,95%CI:-13.22%~3.80%,P=0.253)。其中,城市儿童的肝癌标化发病率呈下降趋势(AAPC=-3.52%,95%CI:-6.82%~-0.10%,P=0.045),农村儿童的肝癌标化发病率成上升趋势(AAPC=4.95%,95%CI:1.40%~8.63%,P=0.011)。城市儿童的标化发病率高于农村儿童(Z=-4.071,P<0.001),男童的标化发病率高于女童(Z=-2.425,P=0.015),0~4岁年龄组儿童的标化发病率明显高于5~9岁和10~14岁年龄组(H=22.285,P<0.001)。2006—2017年儿童的乙肝与肝癌发病率均呈下降趋势,且存在显著相关性(r=0.775,95%CI:0.319~0.927,P=0.005)。结论2006—2017年中国儿童的肝癌发病率呈下降趋势,且存在明显的城乡、性别和年龄组差异,今后应将城市地区、0~4岁年龄组的男童作为重点防控对象。

人55型腺病毒Fiber Knob蛋白原核表达、纯化及活性检测

[目的]构建Fiber Knob原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导其表达,纯化具有良好生物活性的Fiber Knob重组蛋白。[方法]从人55型腺病毒(HAdV-55)中通过PCR扩增目的基因片段Fiber Knob,将该片段与原核表达载体pET15b-His连接,构建重组原核表达质粒pET15b-Fiber Knob-His,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达目的蛋白,通过镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白的表达与纯度。ELISA检测目的蛋白的生物学活性。[结果]重组表达质粒经双酶切和测序鉴定证明构建正确。重组蛋白主要以包涵体形式存在,上清中也有少量表达,重组蛋白相对分子质量约为25 kDa且纯度95%以上,ELISA结果显示制备的Fiber Knob蛋白与CD46胞外域蛋白之间存在直接的相互作用,并且这种相互作用是剂量依赖性的。[结论]成功构建了原核表达质粒pET15b-Fiber Knob-His,在大肠杆菌中成功诱导表达了Fiber Knob蛋白,纯化的Fiber Knob蛋白具有明显结合CD46胞外域蛋白的生物学活性,为其单克隆抗体的制备及人55型腺病毒新的细胞受体的发现奠定了基础。