自噬介导的克唑替尼耐药对间变性淋巴瘤激酶阳性间变性大细胞淋巴瘤肿瘤干细胞样细胞亚群的影响及意义

目的探讨间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中自噬介导的克唑替尼耐药对肿瘤干细胞样细胞亚群的影响。方法本课题组前期通过植入Sox2报告基因已将ALK+ALCL Karpas299细胞株分为报告基因非反应型(RU)细胞和报告基因反应型(RR)细胞,其中RR细胞具备干细胞特性。通过慢病毒感染技术构建荧光标记的LC3过表达RR和RU细胞(分别为RR-LC3、RU-LC3),蛋白质印迹法及流式细胞术验证感染效率。RU-LC3和RR-LC3细胞使用不同浓度(0、250、500、1000 nmol/L)克唑替尼处理后,采用双信号流式细胞术检测RED、GEN信号(RED代表下一代远红色荧光蛋白TagFP635 mKate的红色信号B695,GEN代表来自pH敏感的GFP变体pHluorin的绿色信号B530),以RED/GEN表示自噬通量。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞自噬相关基因ULK1、WIPI1、LC3B mRNA表达水平。MTS法检测不同浓度(250、500、1000 nmol/L)克唑替尼联合氯喹(5、10μmol/L)对细胞存活的影响。结果成功构建过表达LC3的RR-LC3和RU-LC3细胞。250、500、1000 nmol/L克唑替尼诱导下,RU-LC3细胞中RED/GEN分别为1.135±0.017、1.453±0.017和1.755±0.021,RR-LC3细胞中分别为1.193±0.018、2.116±0.013和3.307±0.189,RU-LC3细胞和RR-LC3细胞中RED/GEN均呈剂量依赖性增加;相同浓度克唑替尼作用的RR-LC3细胞中RED/GEN均高于RU-LC3细胞,差异均有统计学意义(均P<0.01);表明RR-LC3细胞较RU-LC3细胞自噬通量变化大。未经克唑替尼处理时,RR细胞中ULK1、WIPI1、LC3B mRNA相对表达量均高于RU细胞(1.69±0.05比1.01±0.02,t=-1.62,P<0.01;1.24±0.04比1.03±0.05,t=-2.11,P<0.01;1.70±0.22比1.02±0.05,t=-1.74,P=0.033)。无氯喹作用时,RR细胞克唑替尼半数抑制浓度(IC_(50))高于RU细胞(950 nmol/L比709 nmol/L)。氯喹作用后,RU细胞IC_(50)无变化;RR细胞IC_(50)随氯喹浓度增加而降低。结论与RU细胞相比,具有肿瘤干细胞特征的RR细胞自噬反应更快速、强烈,这可能是其对克唑替尼耐药的重要原因之一。