毕赤酵母含硫氨基酸生物合成途径

含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕赤酵母可通过O-乙酰同丝氨酸及O-乙酰丝氨酸与无机硫元素合成含硫氨基酸,甲硫氨酸与半胱氨酸也可通过转硫途径实现相互转化。另外毕赤酵母cys3Δ突变菌株在未添加半胱氨酸的合成培养基中对硒代甲硫氨酸表现出显著的抗性。综上所述,未来有望应用毕赤酵母表达硒蛋白用于蛋白质三级结构的分析。

布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(E.coli)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。

Ogataea minuta来源的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和纯化

在大肠杆菌中表达有活性的Ogataea minuta来源的内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoOm),利用p ET系统过量表达Endo-Om。在优化宿主菌及培养条件后,镍柱纯化目的蛋白质,并检测纯化后的Endo-Om对荧光标志的寡糖链的水解活性。经IPTG诱导后,目的蛋白质可以很好地表达,但大部分存在包涵体中。通过培养条件优化,16℃在Overnight ExpressTMInstant LB培养基(默克)中培养,实现了Endo-Om在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,并检测到了纯酶的水解活性。在大肠杆菌中成功纯化了有活性的Endo-Om蛋白,为加速研究该酶的结构和功能奠定了基础。

Dfg5在酿酒酵母细胞壁合成中的功能分析

酿酒酵母中合成的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)一半停留在细胞膜上,另一半被转运至细胞壁的β-1,6-葡聚糖上形成GPI锚定细胞壁蛋白(CWPs)。有分析指出,Dfg5和Dcw1是定位于细胞膜的GPI锚定蛋白,可能以同工酶的形式参与GPI-APs转运。但这两个同源蛋白的分子作用机制尚不清楚。为探究Dfg5的作用机制,本研究构建了dfg5?驻PMET3DCW1条件突变菌株。研究发现在DCW1表达抑制型突变株中Cwp1在细胞膜上大量积累。对Dfg5中与甘露糖苷酶催化活性相关保守氨基酸位点分别定点突变,产生的突变蛋白Dfg5W71A、Dfg5D122A、Dfg5D123A无法回补条件突变株的生长缺陷。然而截断Dfg5前导肽的分泌型Dfg5则可回补条件突变株的生长缺陷。上述结果可推测在GPI-APs锚定至细胞壁中,Dfg5至少具有糖苷酶,可将Cwps从细胞膜上的GPI锚中释放出来。

哺乳动物细胞中糖链结构的改造

由于蛋白质需要正确的折叠和糖基化修饰,目前生物药用蛋白质主要通过哺乳动物细胞生产。然而利用哺乳动物细胞生产医药蛋白质也面临着高成本、糖链不均一等问题。本研究中,我们构建了敲除高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ的HEK293细胞株,其中MAN1A1和MAN1A2双敲除细胞株D-KO35中蛋白质上高甘露糖型N-比例增加。在这株双敲细胞中,溶酶体膜蛋白LAMP2上的糖链对糖链内切酶-H处理敏感,证明蛋白上N-糖链结构以高甘露糖型结构为主。研究结果表明,在哺乳动物细胞中敲除高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶的细胞株,可用于生产均一化N-糖链结构的重组糖蛋白。

用中国仓鼠卵巢细胞构建内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶筛选系统

糖苷水解酶85家族的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶具有糖基转移酶活性,利用该类酶,可以合成特定结构N-糖链修饰的糖基化复合物。为构建糖基转移酶筛选系统,将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的跨膜定位区域与绿色荧光蛋白融合表达,成功把带有天冬酰胺连接糖基化位点的单体增强绿色荧光蛋白定位到中国仓鼠卵巢细胞的高尔基体中。流式细胞仪分析显示,融合了定位区域后,绿色荧光蛋白仍可以发出荧光,且在引入糖基化位点后,细胞荧光强度约降低10倍。经衣霉素处理,细胞糖基化被抑制,同时荧光强度减弱。此细胞株荧光强度对于糖基化水平的依赖性表明其在糖基转移酶的进化筛选方面的应用潜力。