基于SKP-SCs来源的胞外囊泡构建的组织工程神经移植物的生物安全性评价

目的:评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化成的施万细胞(Schwann cells,SCs)来源的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)构建的组织工程神经移植物(tissue engineered nerve graft,TENG)的生物安全性。方法:将SKP-SCs来源的EVs(SKP-SC-EVs)注射至带有3根纤维支架的壳聚糖导管中制备成TENGs,修复比格犬坐骨神经40 mm缺损。术后6个月,取心、肝、脾、肺、肾、脑,通过HE染色进行形态学观察,并收集血液进行血液常规和生化指标分析,包括:白细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶和血糖等。结果:形态学分析显示TENGs组比格犬的各脏器组织结构清晰,与自体移植组、壳聚糖导管组相比,各项血液指标差异均无统计学意义(均P>0.05),且未见毒性反应改变。结论:基于SKP-SC-EVs构建的TENGs植入比格犬体内具有良好的生物安全性,为临床应用TENGs治疗周围神经损伤提供安全性数据支持。

基于SKP-SCs来源胞外囊泡构建的神经移植物桥接周围神经缺损的生物安全性评价

目的:评价基于皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化的施万细胞(Schwann cells,SCs)来源的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)构建的神经移植物用于修复周围神经缺损的生物安全性。方法:构建大鼠坐骨神经离断模型,将基质胶装载的SKP-SC-EVs注射至硅胶管制备含囊泡神经移植物(EV-NG),修复坐骨神经损伤。观察术后大鼠运动状态,12周后收集血液进行血常规和生化指标分析,取心、肝、脾、肺、肾、脑组织切片通过HE染色进行病理组织学分析。结果:病理检查显示各组大鼠各重要脏器组织结构清晰,血常规和生化指标均在正常参考范围内,与假手术组比较,EV-NG组与假手术组的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:装载SKP-SC-EVs的神经移植物具有良好的生物安全性,为临床治疗周围神经缺损提供安全性依据。

双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好。结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-αmRNA的定量检测。

双重实时荧光定量PCR检测人维生素D受体的方法学构建

目的 建立单管检测人维生素D受体（VDR）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的双重实时荧光定量聚合酶链反应（dual real-time PCR）的方法。方法 以GAPDH基因为内参,采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物及Taq Man探针,进行PCR扩增检测VDR基因。将VDR及GAPDH扩增产物片段纯化后克隆构建成重组质粒,作为定量检测基因表达的标准品,并用于分析该方法的灵敏度和重复性。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为VDR及GAPDH特异性片段;该方法检测VDR与GAPDH灵敏度达40拷贝/μL;线性范围为4.00×10~1~4.00×10~5拷贝/μL;决定系数R2分别为0.998、0.999;扩增效率E分别为96.10%、85.15%;批内变异系数（CV）分别为0.09%~1.21%、0.35%~0.88%;批间CV分别为0.17%~0.51%、0.51%~2.46%。结论 成功建立了单管检测人VDR及GAPDH的双重实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、可快速高通量检测VDR的相对表达量,有效缩短时间,减小实验误差。

hsa-miR-10b在3株宫颈癌细胞系中的表达及靶基因预测

目的分析3株宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达水平,并预测hsa-miR-10b的靶基因。方法用PCR技术检测3株宫颈癌细胞系中hsa-miR-10b表达水平;Pub Med检索hsa-miR-10b相关文献;miRbase和NCBI分析其序列保守性及所在基因组特征;TargetScan、PicTar及miRanda数据库预测其靶基因,并结合已证实的靶基因对其进行功能和信号通路富集分析。结果与C-33A相比,HeLa和CaSki中hsa-miR-10b表达水平显著下调(P<0.01);hsa-miR-10b与多种肿瘤的发生发展有关;hsa-miR-10b定位于人染色体2q31.1,在各物种之间具有高度保守性;其靶基因主要参与转录、基因表达调控和细胞增殖等生物学过程(P<0.05),涉及肿瘤、细胞周期和ARF等信号通路(P<0.05)。结论 hsa-miR-10b功能广泛,与宫颈癌的发生发展密切相关,靶基因的预测为后续研究提供依据。

双重荧光实时PCR法鉴定SRBⅠ基因敲除小鼠

目的建立一种双重荧光实时PCR鉴定B族Ⅰ型清道夫受体(SRBⅠ)基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA,应用自行设计的鉴定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探针,经PCR扩增后,在FAM通道及CY5通道判断小鼠基因型。同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果仅在FAM通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因野生型小鼠,仅在CY5通道出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因敲除型小鼠,在两个通道都出现典型S型扩增曲线的为SRBⅠ基因杂合型小鼠。结果与DNA测序法吻合,检测野生型和突变型的灵敏度均达4×101拷贝/μL。结论新方法简单、快速、准确,适用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

鉴定载脂蛋白M基因敲除小鼠的实时荧光定量PCR法的建立

目的建立新型的载脂蛋白M(apolipoprotein M,apo M)基因敲除小鼠的鉴定方法。方法根据荧光PCR原理,分别设计野生型和敲除型apo M基因的引物和探针,并通过6-羧基荧光素(FAM)和3H-吲哚菁染料(CY5)双荧光通道的扩增曲线判断小鼠的基因型。结果野生型小鼠仅在FAM通道有扩增曲线,敲除型小鼠仅在CY5通道有扩增曲线,杂合型小鼠则在FAM及CY5通道均有扩增曲线。结论建立的实时荧光定量PCR法经济、快速、简单、准确、易判断,适用于小鼠apo M基因型的鉴定。

载脂蛋白M对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中相关炎性因子表达的抑制作用

目的观察高糖培养环境下人视网膜血管内皮细胞（HRECs）中载脂蛋白M（ApoM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达的变化，探讨ApoM过表达对高糖诱导的HRECs中TNF-α和MCP-1表达的抑制作用。方法采用含体积分数10%胎牛血清（FBS）和5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基培养HRECs后分为6个组。正常对照组细胞进行常规培养，高糖组细胞用含30 mmol/L D-葡萄糖的高糖培养基进行培养，ApoM过表达组用载有ApoM序列的慢病毒载体感染常规培养的细胞，空载组用无ApoM序列的慢病毒载体感染常规培养的细胞，空载＋高糖组用高糖培养基培养空载体感染的细胞，ApoM过表达＋高糖组用高糖培养基培养ApoM感染的细胞。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中ApoM、TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量；采用Western blot法检测细胞中ApoM蛋白相对表达量。结果实时荧光定量PCR法检测显示，高糖组细胞中ApoM、TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（t＝5.517、3.295、2.555，均P〈0.05）。HRECs感染慢病毒后生长良好，ApoM过表达组细胞中ApoM mRNA相对表达量为236.400±39.270，明显高于空载组的1.000±0.153，差异有统计学意义（t＝5.995，P〈0.01），空载组细胞中未见ApoM蛋白表达条带，ApoM过表达组蛋白表达条带较强。正常培养基和高糖培养基培养后24 h，ApoM过表达组中ApoM蛋白相对表达量分别为1.000±0.249和2.978±0.285，差异有统计学意义（t＝5.056，P〈0.01）。空载组、空载＋高糖组、ApoM过表达组、ApoM过表达＋高糖组细胞中TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量的总体比较差异均有统计学意义（F＝5.966，P＝0.026；F＝14.410，P＝0.002），ApoM过表达＋高糖组细胞中TNF-α mRNA和MCP-1 mRNA相对表达量明显低于空载＋高糖组，差异均有统计学意义（P＝0.017、0.004）。 结论高糖培养早期可上调HRECs中ApoM、MCP-1和TNF-α的表达，过表达ApoM能够抑制高糖诱导的MCP-1和TNF-α表达的上调。

人脐静脉内皮细胞1-磷酸鞘氨醇受体鉴定及其应用探讨

目的鉴定人脐静脉内皮融合细胞株EA.hy926 和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）CRL-1730 1-磷酸鞘氨醇受体（S1PR）亚型和胞浆中C-myc 及His 标签蛋白的表达情况,为研究载脂蛋白M（ApoM）-1-磷酸鞘氨醇轴（ApoMS1P轴）的功能提供参考.方法体外培养EA.hy926 及CRL-1730 至细胞密度达到60%～70%时,采用细胞免疫荧光技术鉴定内皮细胞标志凝血八因子（FⅧ）、ApoM、S1PR1-S1PR5、C-myc 和His 标签蛋白.结果（1）两种细胞均表达FⅧ和ApoM,FⅧ在CRL-1730 中呈散在颗粒状分布,在EA.hy926 中呈均匀分布.（2）两种细胞均主要表达S1PR1,少量表达S1PR2 和S1PR3,不表达S1PR4 和S1PR5.（3）两种细胞胞浆中均有C-myc 和His 标签蛋白的表达.结论两种细胞都具有内皮细胞的特性;因其自身表达ApoM、C-myc 和His 标签蛋白,在应用这两种细胞研究ApoM-S1P 轴的功能时,不适合选用带有C-myc 和（或）His 标签的重组ApoM 蛋白.

载脂蛋白M对肾癌细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用

目的:研究人载脂蛋白M(apolipoprotein M,Apo M)对肾透明细胞癌细胞株(ACHN、769-P和786-O)增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:采用装载人Apo M基因的慢病毒和阴性对照组慢病毒分别感染肾癌细胞株,建立Apo M过表达组(Apo M-OE组)和阴性对照组(NC组)细胞模型。应用CCK-8增殖实验和克隆形成实验观察细胞增殖能力,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果:Apo M过表达后,ACHN和769-P过表达组细胞在72h增殖能力显著降低(分别P<0.01,P<0.05);786-O细胞在48 h表现出明显差异(P<0.001)。克隆形成实验表明Apo M过表达后,3株细胞克隆形成能力明显减弱(分别P<0.001,P<0.01,P<0.01)。细胞划痕实验证实ACHN和769-P过表达组细胞在12 h时出现明显差异(分别P<0.05,P<0.001);786-O细胞在24h时迁移能力明显受抑(P<0.01)。细胞侵袭实验发现3株细胞过表达A po M后侵袭能力下降(分别P<0.001,P<0.001,P<0.01)。结论:Apo M过表达后,肾癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著减弱。

快肌与慢肌失神经支配后的形态学变化

目的:探讨快肌(胫前肌)与慢肌(比目鱼肌)在失神经支配过程中的形态学差异。方法:本研究拟采用大鼠坐骨神经离断模型,通过组织病理学系统分析失神经支配过程中胫前肌与比目鱼肌在形态学方面的变化。结果:在坐骨神经损伤后不同时间点,将比目鱼肌的萎缩程度与胫前肌相比,显示比目鱼肌的萎缩程度较胫前肌严重,主要表现在比目鱼肌的肌肉湿重比较小、肌纤维截面积比率较低、超微结构较不完整、运动终板破损较严重。结论:失神经支配后慢肌萎缩程度较快肌严重。

基于二维PCR技术的高危型人乳头瘤病毒及相关肿瘤抑制基因 p53和 RB1的分型检测方法

目的应用高通量二维PCR技术(2D-PCR), 建立一种单管一步法检测和鉴定宫颈细胞中16种高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)亚型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82)、p53(rs1042522)和RB1(rs3092905)基因型的方法。方法根据16种不同亚型HR-HPV、p53及RB1基因DNA序列设计特异性引物, 同时将待测靶基因p53及RB1基因作为评判标本取样及PCR扩增成功与否的内参基因。在3个荧光检测通道中, 采用相应标签标记不同亚型HR-HPV、p53及RB1的上游引物, 并构建完善的2D-PCR检测体系。应用该方法检测804份来源于常州市第一人民医院2022年12月至2023年8月妇科门诊的宫颈刷样本, 将检测结果与PCR-反向点杂交法、流式荧光杂交法、单重实时荧光定量PCR法分别进行一致性比较;同时采用Sanger测序法检测p53和RB1的基因型。采用Kappa检验评价2D-PCR法和其他方法间的一致性。结果 2D-PCR可通过FAM、HEX和Alexa Fluor568通道的特征性熔解谷对16种HR-HPV型别和p53、RB1的基因型进行准确区分和鉴定。2D-PCR法与PCR-反向点杂交法具有较高的一致性(Kappa=0.699), 与流式荧光杂交法具有更高的一致性(Kappa=0.793), 和单重荧光定量PCR法的一致性Kappa=0.880(95%CI 0.862~0.907)。以Sanger测序法为金标准, 2D-PCR法检测p53、RB1基因型的准确度为100%。p53 rs1042522 位点3种基因型(G/G型、G/C型和C/C型)的分布频率为32.09%(258/804)、49.88%(401/804)和18.03%(145/804), RB1 rs3092905位点检出基因型均为A/A型。结论成功开发了一种2D-PCR方法, 用于高危型HR-HPV型别鉴定与宫颈癌相关肿瘤抑制基因p53和RB1的基因分型。

运用循证医学理念改革文献信息检索教学

阐述高校开展信息检索教育的重要意义,分析目前我国高校文献检索课的现状及存在的问题,并通过具体论证再运用循证医学的教学理念来进行教学改革。在教学改革方面提出了与专业课程教育相结合,开展网络教学等教学方式来提高高校文献检索课的教学质量。

乳腺癌中ApoM差异表达及其对HER2阳性且HR阳性乳腺癌细胞株的生物学影响

目的探讨载脂蛋白M(ApoM)在乳腺癌中差异表达及其对人表皮生长因子受体2(HER2)阳性且激素受体(HR)阳性的乳腺癌细胞株BT-474和ZR-75-1的生物学影响。方法检测55例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中ApoM表达水平。应用慢病毒载体构建ApoM过表达体系并转染HER2阳性且HR阳性的乳腺癌细胞株BT-474和ZR-75-1,并分为ApoM过表达(ApoM-OE)组和空病毒对照组。采用CCK-8细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验分析ApoM对HER2阳性且HR阳性BT-474和ZR-75-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果癌组织中ApoM的mRNA水平较癌旁组织降低(P<0.05)。BT-474和ZR-75-1细胞中ApoM mRNA表达水平低(P<0.05或P<0.01)。转染后,BT-474和ZR-75-1细胞ApoM-OE组ApoM mRNA表达水平升高(P<0.01)。ZR-75-1细胞中ApoM-OE组在24、48、72 h细胞增殖率下降(P<0.05或P<0.01)。BT-474细胞中ApoM-OE组在24、48 h的划痕面积百分比升高(P<0.05或P<0.01)。BT-474和ZR-75-1细胞中ApoM-OE组侵袭细胞数下降(P<0.05)。结论 ApoM在乳腺癌组织中表达降低,过表达ApoM可以抑制HER2阳性且HR阳性乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。