绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定

为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 。

胚胎干细胞联合羊膜移植治疗早期严重眼化学伤的实验研究

【目的】探讨应用胚胎干细胞联合羊膜移植治疗早期严重眼化学伤。【方法】将培养的表达绿色荧光蛋白的胚胎干细胞(ES—GFP细胞)接种于羊膜,5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记后对严重化学伤模型眼行胚胎干细胞羊膜移植,实验共分3组,对照组、单纯羊膜移植、羊膜+ES细胞移植组,每组12只12眼,通过荧光示踪、病理学、免疫组织化学等检查,观察胚胎干细胞的生长分化和移植治疗效果。【结果】ES-GFP细胞能贴附在羊膜上呈集落状生长,移植治疗术后第14天,角膜溃疡穿孔:对照组5眼、单纯羊膜移植2眼、羊膜+ES细胞移植组0眼,对照组和羊膜+ES细胞移植组比较,P=O.037<0.05:角膜新生血管和角膜混浊:对照组、单纯羊膜7植组和羊膜+ES细胞移植组得分分别为3.57±0.53,2.20±0.41,1.40±0.36,和3.72±0.49.2.8±0.42,2.25±0.45, 羊膜+ES细胞移植组与对照组和单纯羊膜移植组比较P均<0.01:病理学等检查羊膜+ES细胞移植组:角膜表面羊膜呈均匀红染的纤维样结构,羊膜下多层上皮样细胞,角膜基质少量细胞浸润,新生血管少见,后弹力层轻度肿胀,上皮细胞.AE-5染色阳性,细胞核内可见BrdU阳性颗粒,荧光显微镜检查角膜上皮层可见绿色荧光带。【结论】以羊膜为载体培养ES细胞,移植到早期严重眼化学伤的眼表,ES细胞诱导分化为角膜上皮样细胞。

新生乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间质干细胞向视网膜神经样细胞分化

目的探讨体外培养的新生乳鼠视网膜细胞对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法取成年Wistar大鼠股骨全骨髓细胞体外培养,经多次传代后获得高纯度的骨髓间质干细胞。以新生乳鼠视网膜细胞作诱导条件,采用分层共培养的方法诱导骨髓间质干细胞。倒置相差显微镜观察骨髓间质干细胞与新生乳鼠视网膜细胞共培养后形态的改变;免疫组织化学法检测诱导后的细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微丝微管相关蛋白-2(Map-2)、Thy11、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标记物的表达;RT-PCR进一步分析诱导后细胞表达nestin、NF、NSE、Thy11及Ran等mRNA的情况。结果新生乳鼠视网膜细胞作诱导剂,诱导48h后可见部分细胞长出突起并向视网膜神经元特性样的细胞分化,最长可维持10d。结论骨髓间质干细胞在体外培养的新生乳鼠视网膜细胞的诱导作用下可以向视网膜神经元样细胞分化。

神经营养因子诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究

目的 探讨神经营养因子诱导成年大鼠骨髓基质细胞成神经细胞的可能性,为神经再生及视神经疾病的治疗提供一种新方法。方法 从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第6代,诱导前24h光用含1μg/L bFGF及 20％FBS的DMEM培养液培养,以促迸细胞分裂,然后用神经生长因子（NGF）和脑源性神经生长因子（BDNF）作诱导剂,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达Nestin、NF、NSE、Map-2、GFAP等特异性标志物。结果 诱导后1h,部分细胞的形态已发生改变,5h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征,而且Nestin、NF、NSE及Map-2等特异性抗体呈阳性表达,而GFAP抗体表达呈阴性。结论 神经营养因子能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞。

诱导胚胎干细胞向角膜上皮细胞分化的实验研究

探索胚胎干细胞在表层角膜缘基质诱导下向角膜上皮细胞分化的可能性.体外培养带GFP标记的ES-D3细胞,并利用视黄酸进行预诱导,然后将预诱导后的细胞接种在表层角膜缘基质上,细胞融合形成单层后,随机分为3组进行研究:第1组传代后直接进行检测;第2组在气-液界面上培养10天,然后植入裸鼠皮下以进行体内诱导;第3组作为对照组,不给予GFP-ES-D3细胞特殊诱导条件,细胞自由分化.诱导分化的细胞植入裸鼠皮下体2周后没有畸胎瘤形成.诱导分化的细胞呈现上皮样外观,体内诱导组和体外诱导组免疫组织化学染色均检测到CK3,P63和PCNA表达阳性,电子显微镜检查可见两组细胞表面都有微绒毛和细胞间紧密连接形成.实验对照组部分细胞脱落和死亡,大部分表现神经样细胞的树突样外观,小部分未死亡的贴壁细胞呈多态性,这些结果表明胚胎干细胞在特定条件下经表层角膜基质诱导能够分化为角膜上皮细胞.胚胎干细胞诱导分化有可能为眼表重建和组织工程化角膜的构建提供上皮种子细胞.

转染肝癌总RNA的树突状细胞疫苗对肝癌的抑制作用及其机制

目的探讨转染肝癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DC)疫苗抑制肝癌作用及其机制。方法采用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4联合培养6 d成小鼠骨髓来源不成熟DC(iDC),质脂体转染肝癌细胞系Hepa1-6 RNA入iDC,用LPS刺激后成为Hepal-6 RNA/DC疫苗,对照组为iDC组、LPS/DC组Saline组,以每只2×10~6个细胞腹腔注射免疫小鼠每周1次共3次,然后接种5×10~5 Hepal-6细胞,观察肿瘤生长情况、特异性CTL活性的测定以及抗体阻断实验。结果实验组Hepal-6 RNA/DC组肿瘤在第8周为(8．5±3．6)mm,而iDC组、LPS/ DC组、Saline对照组分别为(36．6±3．6)、(31．3±4．7)、(32．2±4．0)mm,与实验组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。实验组脾细胞对Hepal-6细胞有特异性杀伤效应,而对肺癌LLC细胞无杀伤活性。所诱导的抗肿瘤效应细胞包括CD^(8+)、CD^(4+)T淋巴细胞。结论肝癌细胞的总RNA转染的DC肿瘤疫苗能诱导CD^(8+)、CD^(4+)T细胞免疫,是较有临床应用前景的肝癌免疫治疗方法。