超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-高分辨质谱法分析6种李果实中的代谢物差异性

目的采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间高分辨质谱法分析6种李果实中的代谢物差异。方法使用天然产物高分辨二级谱库、代谢物高分辨二级谱库和相关数据库等对不同李果实样品中的代谢产物进行数据分析,利用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量,采用主成分分析方法、偏最小二乘法判别分析和方差分析等方法,分析不同李果实样品中代谢产物的差异。结果共分析鉴定了130个化学成分,其中包括28个黄酮类、25个脂肪酸、18个萜烯类、11个核苷酸、10个酚酸、9个香豆素类、8个含氮化合物、6个酚类以及15个其他类化合物;在所鉴定的130个化合物中,有123个化合物对各组李果实均值间的差异具有统计学意义(P<0.05);6组不同品种李果实的数据间具备很好的区分度,贡献最大的化合物共有32个。结论6个品种李果实存在相同种类的代谢产物,各代谢产物在不同品种李果实中的相对含量存在显著差异性,为李果品种选育、区分以及产地溯源等提供参考。

家蝇酵母双杂交cDNA文库构建和MD14-3-3互作蛋白筛选

【目的】构建家蝇Musca domestica酵母双杂交cDNA文库,筛选MD14-3-3互作蛋白。【方法】以家蝇为研究对象,经mRNA纯化、cDNA初级文库构建、重组pGADT7-DEST构建次级文库,构建酵母双杂交筛选系统,构建pGBKT7-MD14-3-3质粒作为诱饵筛选与MD14-3-3相互作用的蛋白,并进行回转验证。【结果】成功构建文库容量为1.6×10^(7) CFU,重组率为100%的家蝇酵母双杂交cDNA文库。酵母双杂交筛选获得2个靶蛋白,回转试验表明mucin-like protein HKR1与抗菌肽ctenidin-1为MD14-3-3的互作蛋白。【结论】从成功构建的家蝇酵母双杂交cDNA文库中筛选出MD14-3-3蛋白的2个互作蛋白,为进一步探究家蝇免疫应答机制奠定了基础。

家蝇幼虫分泌物抗菌肽的生化特性初步研究

研究了不同温度、蛋白酶及反复冻溶对家蝇Musca domestica幼虫活体浸泡法获得的分泌物抗菌肽抗菌活性的影响;并检测其凝血效应;试管稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC);SDS-PAGE分析其分子量范围。结果表明,该抗菌肽具有较强的热稳定性、酶稳定性及较强抗菌活性的特性,无凝血作用。对大肠埃希菌的最低抑菌浓度为37μg/mL、最低杀菌浓度为75μg/mL;分子量约10kD。

家蝇幼虫分泌物抗菌肽的分离及其部分特性

目的分离家蝇(Musca domestica)幼虫分泌物抗菌肽并研究其部分理化特性。方法用超滤、固相萃取、反相高效液相色谱(RB-HPLC)分离纯化家蝇幼虫分泌物抗菌肽;测定抗菌肽对多株革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);比较其在不同pH值(pH 6．0～9．0)、不同阳离子浓度(Mg2+:(0.5×10-3～10．0×10-3)mol／L, Na+、K+:(10×10-3～100×10-3)mol／L)及不同小鼠血清浓度(12．5％～75％)环境中抗菌活性的变化。结果超滤分离获得的活性蛋白相对分子质量为Mr 3000～30000,该蛋白经20％、30％、70％及80％乙腈洗脱,其组分均有活性,其中以70％乙睛洗脱组分活性较强且稳定。进一步用RP-HPLC从70％洗脱组分中纯化出两个抗菌活性肽。抗菌肽对大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的MIC值分别为32．738、16．369、65．475及32．738μg/ml。在培养基pH值为6～9、不同阳离子浓度及不同小鼠血清浓度的环境中,各实验组的A570增加量均小于0．05,而对照组的A570增加量多为0.3以上,各实验组与对照组比较,其差异均具有统计学意义(P值均<0．01)。结论用固相萃取等方法从家蝇幼虫分泌物中可快速分离出具有较强活性的抗菌肽。该抗菌肽在不同条件下均具有较好的抗菌效果。

家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达

目的对EST筛选得到的家蝇几丁质酶Ⅰ(MDCⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中表达。方法采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MDCⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR方法对MDCⅠ基因进行扩增,以pET 28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果 MDCⅠ基因全长751bp,编码251个氨基酸,理论分子量28.62家kDa;等电点5.78,有1个chitinase 18家族的活性位点。构建了具有正确基因序列的MDCⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论 MDCⅠ基因可在原核表达系统中表达,为进一步研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。

家蝇泛素结合酶基因的生物信息学分析

利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇泛素结合酶基因(MD-E2)cDNA序列,采用NCBI、ExPASY中的相关工具,对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,MEGA软件构建了进化树。结果表明,家蝇泛素结合酶基因的cDNA序列具有完整的ORF框,全长480 bp,一共编码159个氨基酸。其编码的蛋白质理论分子量为18.117 9 kD,等电点8.64,无信号肽及跨膜区,属于亲水性蛋白,具有泛素结合酶家族的活性位点(FHPNVYPSGTVCLSLL),主要分布于细胞核;二级结构以无规则卷曲为主,β折叠较少。

家蝇幼虫分泌物对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

目的研究家蝇幼虫分泌物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、乳酸脱氢酶(LDH)活性及一氧化氮(NO)含量的影响。方法以甲醇为洗脱液,用固相萃取法初步分离家蝇幼虫分泌物,液体培养法检测各萃取组分抗菌活性,比色法检测萃取组分对巨噬细胞吞噬中性红能力及LDH活性的影响;Griess法测定NO含量。结果分泌物经甲醇萃取分离后,30%,40%萃取组分显示较强抗大肠埃希菌活性;经该两个梯度萃取组分作用后,巨噬细胞的吞噬率分别为(1.48±0.12)%,(1.26±0.08)%;LDH活性单位分别为(450.32±1.15)及(306.57±2.06);诱生NO的浓度分别为(28.5±3.4)μmol/L,(25.6±2.8)μmol/L,与对照组相比均有明显的统计学意义(P<0.05)。结论家蝇幼虫分泌物经初步纯化后,对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、LDH活性及NO的诱生均有显著的增强作用。

家蝇14-3-3蛋白基因的cDNA克隆与序列分析

从家蝇cDNA文库中筛选获得家蝇14-3-3(MD14-3-3)基因DNA序列,以该基因的cDNA文库质粒为模板,PCR方法对MD14-3-3基因进行扩增,以pET 28(a+)为载体构建重组质粒。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,MD14-3-3基因ORF全长771 bp,编码257个氨基酸,理论分子量29.35 kD;等电点5.78,属于亲水性的酸性蛋白,含有多种酶的结合位点,有14-3-3家族结构域和活性位点,定位于细胞核中,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。经PCR、双酶切及NDA测序结果均表明pET 28a(+)-MD14-3-3重组质粒构建成功。

不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育影响

目的分别从饲养家蝇幼虫的饲料残渣及幼虫浸液中提取家蝇幼虫分泌物,初步纯化后观察对猪蛔虫卵发育的影响。方法将家蝇幼虫饲料残渣或3龄幼虫浸泡于适量蒸馏水中4 h,吸取浸液用硫酸胺盐析或透析的方法分离分泌物,所得分泌物分别制成虫卵培养液,观察培养液中猪蛔虫卵发育情况。同时,设立不含家蝇幼虫分泌物的培养液为阴性对照。结果从饲料残渣和幼虫浸液中提取的分泌物0～30%,30%～50%的盐析蛋白液、盐析上清液对虫卵发育均无影响;50%～80%的盐析蛋白液、透析外液可明显阻碍虫卵的发育。结论家蝇幼虫饲料残渣和幼虫浸液中提取的幼虫分泌物均可阻碍猪蛔虫卵的发育,活性物质主要集中在50%～80%的盐析沉淀部分,其分子量〈14KD。

家蝇幼虫分泌物抗菌肽对小鼠血清溶菌酶含量的影响

目的:观察家蝇幼虫分泌物抗菌肽对正常昆明种小鼠血清溶菌酶含量的影响。方法:将小鼠随机分为4组,每组8只。实验组腹腔注射不同剂量(5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)的家蝇幼虫分泌物抗菌肽,1次/d;连续7d后,眼球取血检测小鼠血清中溶菌酶的含量。设立腹腔注射生理盐水的小鼠为对照组。结果:给予抗菌肽后,各实验组和对照组相比,小鼠血清溶菌酶含量均有所提高,其中以10mg/kg和20mg/kg组增高较为显著。结论:家蝇幼虫分泌物抗菌肽能显著提高小鼠血清中溶菌酶含量。

家蝇幼虫生态处理对猪粪和鸡粪中微生物数量的影响

[目的]研究家蝇幼虫生态处理后猪粪、鸡粪中微生物（细菌、真菌、放线菌）数量的变化情况。[方法]猪粪、鸡粪经家蝇幼虫生态处理后,采用稀释平板计数法对样品中细菌、真菌及放线菌数量进行分析,设立未经幼虫处理的猪粪、鸡粪为对照。[结果]正常对照组猪粪在恒温、恒湿条件下放置3~5 d后,细菌、真菌及放线菌的数量达到最高峰,分别为1 378×10^9、3 352.0×10^6和3 48.81×10^7cfu/g。经家蝇幼虫处理后,猪粪中的各类菌数量增加幅度均较小,第5天相应的各类菌落数为158.40×10^9、185.0×106和4.6×10^7cfu/g,总体上呈较为平稳态势。正常对照组的鸡粪前5 d 3种微生物数量增加亦明显,而家蝇幼虫处理组变化均不大。[结论]家蝇幼虫处理猪粪、鸡粪后,能显著降低粪便中细菌、真菌、放线菌的数量。

家蝇幼虫分泌物抗菌组分的抗菌效果观察及筛选

目的筛选家蝇幼虫分泌物中的抗蔺组分并测定其抗菌活性。方法用盐析、凝胶过滤层析、反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化分泌物中抗菌蛋白肽，以大肠埃希茼为指示曲种，采用平板滤纸片法检测抗菌活性，并观察其对金黄色葡萄球菌等多种细菌的抗菌活性。结果经50％～80％硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-100、G-50凝胶过滤往层析分离得到一活性峰，该活性峰埘大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌等细菌显示较强的抗菌作用，进一步用反相高效液相色潜纯化，该活性峰由3个活性组分构成。结论家蝇幼虫分泌物中含有3个抗菌组分，对多种革兰氏阳性及阴性菌具有较强的抗菌活性。

家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育的影响

目的 :观察家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育的影响。方法 :从培养家蝇幼虫的猪粪中提取幼虫分泌物 ,制成虫卵培养液 ,观察培养液中猪蛔虫卵发育情况。同时 ,设立未培养家蝇幼虫的猪粪为阴性对照组。结果 :实验组蛔虫卵的发育率较对照组低 ,两者比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论

生物分泌抗菌物质研究进展

分泌物是生物防御系统的组成之一,从最原始的植物到细菌、真菌、两栖动物乃至高等级的哺乳动物,它们都能利用独特的分泌物来维持自身的菌群平衡及抵御外物尤其是病原微生物入侵。本文从生物分泌物抗菌物质的分类及生物学特性、抗菌机理、应用及展望几个方面对其进行了综述。

酶工程教学模式改革的探索

酶工程是生物技术专业的主干课程,其主要内容是研究酶的生产和应用,该文从优化教学内容、改进教学方法、加强实验和实践教学等方面,介绍了该门课程教学与建设的体会及其思考,以期提高教学效果和人才培养素质。

家蝇幼虫营养成分价值的研究

目的 获得畜禽粪便养殖家蝇生产蝇蛆动物蛋白的实验室数据 ,评价用蝇蛆代替鱼粉饲养蛋鸡的效果及经济效益。方法 在相同的实验室饲养环境下 ,观察人工饲料、猪粪饲养的家蝇幼虫体内脂肪酸及微量元素含量的区别 ;用蝇蛆粉或鲜蛆代替鱼粉饲养蛋鸡 ,观察对蛋质的影响。结果 用猪粪饲养的蝇蛆其体内所含的微量元素 (Ca、Fe、Cu、Zn、Se)高于用人工饲料饲养的蝇蛆 (P<0 .0 5 ) ;用蝇蛆粉或鲜蛆代替鱼粉饲养蛋鸡 ,蛋内的脂肪酸及微量元素含量没有明显改变 (P>0 .0 5 )。结论 用猪粪饲养家蝇可以生产出价廉、优质、富含微量元素的蝇蛆蛋白 。

热胁迫后家蝇幼虫cDNA文库构建与随机EST测序分析

目的构建家蝇幼虫cDNA文库,筛选重要免疫因子。方法采用热激法处理家蝇3日龄幼虫,提取处理后培养24h的家蝇幼虫总RNA,运用SMART技术构建cDNA文库并随机挑选克隆进行EST测序分析。结果 cDNA文库的滴度为1.2×106。PCR扩增鉴定显示所选的30个克隆均含有重组的插入片段,大小均大于1kb。随机挑取192个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为171条,根据EST测序结果计算文库重组率达94%。经序列拼接得到129个Unigenes。通过序列比对发现其中72个Unigenes与GenBank中的已知基因同源,并从中鉴定出热激蛋白、变态原、转铁蛋白、几丁质酶、副肌球蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制因子等重要免疫因子。结论高质量的家蝇幼虫cDNA文库构建成功,该文库的构建将有助于家蝇热应激免疫相关功能基因分离和进一步研究。

蝇蛆蛋白粉对小鼠免疫功能的影响

目的:探讨蝇蛆蛋白粉对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用。方法:利用正常及环磷酰胺(Cy)所致免疫低下模型小鼠,通过血清溶血素含量检测及碳粒廓清指数测定考察蝇蛆蛋白粉对巨噬细胞巨噬功能及体液免疫功能的影响。结果:蝇蛆蛋白粉可显著提高正常小鼠半数溶血值(HC50),对吞噬指数(α)无影响;对免疫功能低下小鼠HC50无影响,但可显著提高其α值。结论:蝇蛆蛋白粉可有效地增强正常小鼠体液免疫功能;对Cy造成的免疫功能低下有一定的预防和治疗作用。

人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响

目的观察和研究人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响。方法以白色念珠菌ATCC10231为效应菌,检测MAF-1A在MIC浓度下不同时间白色念珠菌的孢子萌发率及芽管形成率,瑞氏染色后显微镜计数,观察MAF-1A预处理后及干预下,酵母相和菌丝相白色念珠菌定植人口腔黏膜上皮细胞能力变化;分别设立氟康唑(fluconazole,FLC)和PBS为阳性对照和阴性对照。结果 MAF-1A作用白色念珠菌后,孢子萌发率及芽管形成率小于阳性对照和阴性对照组(P<0.05);MAF-1A可减少白色念珠菌酵母相细胞或菌丝相细胞对人口腔黏膜上皮细胞的粘附数,且减少酵母相细胞粘附作用强于菌丝相细胞(P<0.05);MAF-1A预处理白色念珠菌后,对人口腔黏膜上皮细胞粘附数少于MAF-1A干预组的细胞粘附数(P<0.05)。结论 MAF-1A可通过抑制白色念珠菌孢子萌发和芽管的形成以及有效降低白色念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞粘附能力,从而影响白色念珠菌的致病能力。