人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的：制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb），并鉴定其特异性。方法：纯化的His．DcR3融合蛋白免疫小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化，纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价。结果：获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞，均属IgG1亚型，其腹水抗体效价为1×10^-5～1×10^-7，Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白，其中1株（181）可与SW480细胞成分反应。结论：成功建立稳定分泌抗人DcR3mAb的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体特异性强、效价高，为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。