恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）3D7株AP核酸内切酶（AP endonuclease）的功能,通过PCR的方法扩增PF3D7_0305600（292-1 137 bp）,构建克隆载体。测序正确后,将该片段插入到pET-28a和p GEX-4T-1,构建重组表达载体p ET-28a-Ae、p GEX-4T-1-Ae。将表达载体转入BL21-Codon Plus表达重组蛋白r-Ae-His和r-Ae-GST,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,r-Ae-His免疫家兔制备多克隆抗体,并用ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明：表达的r-Ae-His分子量约为39 ku,r-Ae-GST分子量约为60 ku。制备的多克隆抗体能够特异性地识别天然蛋白,可用于恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的后续研究。

恶性疟原虫蛋白输出机制的研究进展

疟疾是由疟原虫引起的虫媒传染病。近些年,由于疟原虫抗药性的产生和迅速扩散,给疟疾治疗带来严重困难,因此,研制安全有效的疫苗是预防疟疾感染,控制疟疾流行的主要手段之一。疟原虫致病机制研究已经成为研制抗疟疫苗及疾病防控的一项重点,由于多种疟原虫输出型蛋白能够运输到宿主细胞表面进行信息传递并可使虫体逃避宿主的免疫反应,因此研究虫体输出型蛋白转运机制对疟原虫致病机制研究有着至关重要的意义。本文概述了疟原虫蛋白输出的机制,以及NPPs、TVN、MCs、Knobs和PTEX等5种疟原虫重要的蛋白输出结构的研究进展。

恶性疟原虫PfRNase Ⅱ的克隆表达与降解特性的初步分析

目的利用原核表达系统诱导表达恶性疟原虫融合蛋白pGEX-PfRNaseⅡ,并分析其RNA降解特性。方法分析并选取恶性疟原虫3D7株PfRNaseⅡ的活性区,以cDNA为模板PCR扩增目的片段。将目的片段插入到pGEX-4T-1表达载体中,构建pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21-CodonPlus(DE3),利用IPTG诱导表达目的蛋白pGEX-PfRNaseⅡ。应用Glutathione-SepharoseTM 4B树脂纯化目的蛋白。并用pGEX-PfRNaseⅡ体外分析PfRNaseⅡ的RNA降解特性。结果经PCR、双酶切、测序鉴定,pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ重组表达质粒构建正确,转化DE3后在IPTG的作用下表达目的蛋白。纯化的目的蛋白pGEX-PfRNaseⅡ在体外可降解单链RNA,但不能降解双链RNA。pGEX-PfRNaseⅡ在低浓度的Mg2+条件下降解活性较强,高浓度Mg2+条件下活性受到抑制,在5mmol/L EDTA存在下活性降低。结论克隆表达的pGEX-PfRNaseⅡ重组蛋白能水解单链RNA,且该水解活性具有二价金属离子依赖性。

恶性疟原虫Pf332分子DBL、TM和WR功能区蛋白质的转运分析

目的分析恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR 3个功能区蛋白质在虫体内的表达和分布以及与肌动蛋白的结合情况,探讨其在感染红细胞内的转运过程及功能,为进一步研究疟原虫侵入机制及筛选红内期疫苗候选抗原提供理论依据。方法将构建融有GFP基因的恶性疟原虫Pf332分子的Pf332DBL-GFP、Pf332TM-GFP和Pf332WR-GFP重组质粒分别转染到3D7虫株恶性疟原虫,通过活体荧光实时观察DBL、TM和WR蛋白质表达及其在染虫红细胞内的分布,运用间接免疫荧光共定位方法观察蛋白质DBL、TM和WR与肌动蛋白的结合情况。结果转染试验表明,重组DBL-GFP、TM-GFP和WR-GFP基因能在虫体中正常表达蛋白质,该蛋白均分布在染虫红细胞的纳虫泡内,但未能转运到红细胞的胞浆内。间接免疫荧光共定位表明恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白质均未与肌动蛋白(β-actin)结合。结论 Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白在单独表达后自身均不能发生跨膜反应,即不能通过虫体的纳虫泡膜。由此推测,Pf332分子在虫体内合成后很可能通过多个功能基团协同作用转运到红细胞膜部位。

恶性疟原虫3D7株新型裂殖子蛋白质(PF3D7_1361800)的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的用大肠埃希菌表达PF3D7_1361800蛋白,制备多克隆抗体。方法根据PF3D7_1361800蛋白的水溶性分析,设计目的基因引物,采用PCR技术扩增目的基因片段,长度为897bp。将其克隆到pMD18-T载体,测序正确后将该片段连接到pET-28a和pGEX-4T-1表达载体中,测序鉴定正确后将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中,用0.1mmol/L IPTG诱导表达,用His GraviTrapTM和Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白质。用His-tag重组蛋白免疫家兔,每2周免疫一次,分别于免疫后14、28、42、52d采血,用间接ELISA法测定抗体效价。以制备的多克隆抗体作为一抗,采用Western blot分析其特异性。结果经测序和酶切鉴定,成功构建了表达载体pET-PF3D7_1361800和pGEX-PF3D7_1361800。SDS-PAGE分析亲和纯化的重组蛋白纯度较好,间接ELISA法检测该蛋白免疫兔血清抗体效价>1∶16 000。结论成功克隆了PF3D7_1361800的表达载体并表达目的蛋白,制备的抗重组蛋白多克隆抗体具有特异性,为研究该蛋白质的生物学功能及疟疾疫苗的研发奠定了基础。