低氧和复氧对瘤背石磺肠道健康的影响

【目的】分析低氧和复氧对瘤背石磺肠道组织结构、能量代谢和微生物菌群的影响,探究其低氧抗逆和复氧恢复机制,为潮间带生物的抗逆及恢复机制研究提供理论参考。【方法】分别设常氧组(对照组)、低氧组和复氧组,在低氧胁迫4、8、12和24 h后复氧6、12、18、30和42 h,观察瘤背石磺肠道组织结构变化,测定乳酸含量、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)活性,同时分析肠道微生物群落变化情况。【结果】随着低氧胁迫时间的延长,瘤背石磺肠道组织中杯状细胞数量明显增加,至24 h时杯状细胞几乎遍布整个上皮层,复氧后逐渐恢复至正常水平。肠道组织的乳酸含量随低氧胁迫时间的延长呈上升趋势,LDH活性呈先升高后降低的变化趋势,分别在胁迫24和12h时达最高值,且与对照组间存在显著差异(P<0.05,下同),而ACP活性呈先升高后降低再升高的变化趋势,在8 h时降至最低值,且显著低于对照组;复氧后乳酸含量、LDH活性和ACP活性均有所恢复。肠道微生物菌群结构和菌落相对丰度因低氧条件而改变,门水平上优势菌群由对照组的厚壁菌门(Firmicutes)变化到变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和弯曲杆菌门(Campylobacterota);属分类水平上优势菌落从气单胞菌属(Aeromonas)变化到弧菌属(Vibrio),复氧后厚壁菌门(Firmicutes)又恢复优势地位;虽然复氧后菌落的相对丰度呈回升状态,但总体丰度仍低于对照组。LEfSe分析结果显示,对照组与低氧8 h组有20个显著差异群落,且主要集中在内生单胞菌属(Endozoicomonas)和弧菌属等;对照组与复氧组有39个显著差异群落,主要集中在黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和幽门螺杆菌科(Helicobacteraceae)等。【结论】低氧影响瘤背石磺肠道组织结构,导致肠道菌群发生改变,进而影响肠道的抗氧化功能和非特异性免疫功能。

人为噪音胁迫对瘤背石磺氧化应激和免疫应答的影响

为探究人为噪音对瘤背石磺(Onchidium reevesii)氧化应激和免疫应答的影响,将瘤背石磺分别暴露在1000 Hz的人为噪音中1、3、6、12和24 h后,分别测定瘤背石磺血清中超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等氧化应激指标和谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性和碱性磷酸酶(AKP)等免疫指标,同时测定了肝胰腺中热休克蛋白27(Hsp27)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、髓样分化因子(MyD88)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等基因的mRNA表达量变化。结果显示,相对于未暴露组,SOD和CAT活性在噪音暴露1 h后显著升高(P<0.05),AST和ALT活性在噪音暴露3 h后显著升高(P<0.05),AKP活性在噪音暴露1 h后显著升高(P<0.05);Hsp27和GSH-Px基因的mRNA表达量在噪音暴露1 h后显著上调(P<0.05),GST基因的mRNA表达量在噪音暴露1 h后显著下调(P<0.05),MyD88和TNF-α基因的mRNA表达量在噪音暴露1 h后显著上调。研究表明,人为噪音作为一种胁迫因子,使瘤背石磺机体产生了氧化应激和免疫应答,研究结果可为表征潮间带动物应对人为噪声胁迫提供参考依据。

杜仲对草鱼生长、肌肉品质和胶原蛋白基因表达的影响

为研究杜仲对草鱼生长性能、肌肉品质及胶原蛋白基因COL1A1和COL1A2表达的影响,实验采用初始体质量为(215.0±0.4)g的草鱼120尾,随机分为2处理组(每组3重复,每重复20尾鱼),分别饲喂基础饲料(对照组)和添加2%杜仲的实验饲料(杜仲组),养殖时间为8周。结果显示,与对照组相比,添加2%杜仲对草鱼生长性能无显著影响,但能显著增加肌肉、皮肤和肝脏胶原蛋白水平,增加肌肉总必需氨基酸(TEAA)、总氨基酸(TAA)水平。2%杜仲可显著降低草鱼肌肉的冷冻失水率、离心失水率,但对肌纤维密度和肌纤维直径无显著影响。在胶原蛋白基因表达方面,2%杜仲显著增加了第4周、8周时草鱼的肌肉、皮肤和第8周时的肝脏组织COL1A1、COL1A2基因m RNA表达量。研究表明,饲料中添加2%杜仲可改善大规格草鱼的肌肉品质。

瘤背石磺FMRFamide基因的克隆、分析及其在炎症刺激下的表达变化

该文研究了瘤背石磺(Onchidium reevesii)在炎症刺激后体内FMRFamide基因的表达水平变化,以及FMRFamide多肽保持其自身稳态的分子机制。以瘤背石磺转录组中FMRFamide基因片段为基础,通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到该基因cDNA的全长为2618 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为882 bp,编码293个氨基酸,系统进化树显示该基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)FMRFamide基因的亲缘关系最近,这和传统形态学分类相吻合。实时荧光定量结果显示FMRFamide基因在瘤背石磺的不同组织中均有表达,但在神经节部位的相对表达量极显著高于皮肤、腹足、肝胰腺、血细胞、性腺和肌肉组织(P<0.01)。免疫组织化学验证了FMRFamide多肽在组织中与mRNA分布的一致性。炎症刺激实验结果表明,注射脂多糖(LPS)后,实验组神经节、肝胰腺、血细胞和皮肤中FMRFamide基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),且在刺激后第12小时相对表达量达到最高。综上,瘤背石磺FMRFamide主要存在于神经节中,通过神经内分泌系统参与肌体的免疫调节,对炎症刺激下的瘤背石磺保持体内稳态具有重大作用。

瘤背石磺多糖对人宫颈癌细胞的体外抑制作用

体外试验研究瘤背石磺多糖(Onchidium reevesii polysaccharides, OSP)和硫酸酯化修饰后瘤背石磺多糖(Sulfated Onchidium reevesii polysaccharides, S-OSP)对人宫颈癌Hela细胞生长的影响,并以阳性药物顺铂(0.5、0.75、1.5μg/mL)作为对照。将不同质量浓度(50、75、150μg/mL)的OSP和S-OSP作用于Hela细胞,用CCK-8法分析Hela细胞在12、24、48和72 h的增殖情况,用流式细胞仪分析细胞周期,并应用qRT-PCR检测相关凋亡基因的表达变化。结果表明,OSP和S-OSP均能降低Hela细胞活性并诱导其凋亡,而且S-OSP比OSP更能显著抑制Hela细胞增殖活性,表明硫酸酯化修饰改变了多糖结构进而影响多糖抗肿瘤活性。作用48 h后,3种质量浓度OSP组Hela细胞生长抑制率分别为60%、67%和71%;S-OSP组Hela细胞生长抑制率分别为74%、77%和84%;顺铂组Hela细胞生长抑制率分别为82%、86%和90%。流式细胞术检测显示OSP和S-OSP作用24 h后,细胞早期和晚期凋亡的比率显著,G0/G1期细胞比例增多,S期细胞比例不断降低;实时荧光定量表明促凋亡基因Caspase-3的表达量随药物质量浓度的提高显著增加,抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL的表达量随药物质量浓度的提高无明显变化,说明OSP和S-OSP可通过调节Caspase信号通路诱导Hela细胞凋亡。

低氧胁迫对瘤背石磺Toll样受体4、血细胞和免疫酶活性的影响

为探究瘤背石磺面临低氧环境时固有免疫的应激机制,实验以RACE法对瘤背石磺TLR4基因进行全长克隆,并进行生物信息学分析,测定了低氧胁迫下瘤背石磺TLR4基因的表达变化,以及分析了血细胞活力和溶菌酶(LSZ)活性、肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(ALP)活性。结果显示,瘤背石磺TLR4基因cDNA全长共3605 bp,包括编码956 aa氨基酸的2817 bp开放阅读框。系统进化树表明,瘤背石磺TLR4基因与光滑双脐螺TLR4基因的进化地位较为接近。qRT-PCR结果显示,TLR4基因在瘤背石磺7个组织中均有表达,其中表达量最高的是肝脏。低氧胁迫下,各组织中TLR4基因的表达量皆显著上升,其中神经节在4 h时率先达到峰值。此外,血细胞活力、LSZ活性、ALP活性都是呈先下降后上升的趋势,而SOD活性呈先上升再下降再上升的趋势,波动幅度最为明显。研究结果初步说明了TLR4的生理功能,为探究潮间带生物免疫系统的低氧应激机制提供理论参考。

草鱼Hsp27基因的克隆、分析及摄食蚕豆对其表达的影响

热休克蛋白27(Hsp27)是一种小分子热休克蛋白,具有分子伴侣性质,能够与肌动蛋白结合,从而调节肌动蛋白细胞骨架重组。本试验通过c DNA末端快速扩增法(RACE)获得草鱼Hsp27基因全长序列,进行氨基酸序列预测,蛋白质特征分析,以及Hsp27基因的组织差异表达,并检测了草鱼摄食蚕豆过程中Hsp27基因表达量的变化。结果表明:草鱼Hsp27基因cDNA序列全长1271 bp,含417 bp的5’端非编码区、317 bp的3’端非编码区和537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。所编码的氨基酸序列与鲫鱼(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)的同源性分别达83%、76%、75%、70%。草鱼Hsp27蛋白分子质量为19501.39 Da,含178个氨基酸残基,理论等电点为6.20,为亲水性蛋白,不含信号肽;其二级结构和三级结构显示有螺旋和折叠。草鱼Hsp27基因在肝脏、脾脏、脑、肾脏、鳃、肌肉、心脏、皮肤、前肠、血液中均有表达,在心脏和肌肉组织中高表达,肾脏组织表达量最低(p<0.05)。相比对照组,摄食蚕豆后草鱼心脏组织和肌肉组织Hsp27基因的表达量显著升高,表明蚕豆促进了Hsp27的表达,所得结果为后续研究蚕豆脆化草鱼肌原纤维变化的分子机理奠定基础。

草鱼ROCK1基因全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达

ROCK1是ROCK（即Rho激酶）家族的成员之一,ROCK家族是小G蛋白Rho的下游效应因子,被Rho蛋白激活后ROCK1作用于下游效应分子,对其介导的信号通路进行调节,参与细胞增殖、迁移、形态改变等。ROCK1与组织纤维化、癌症、心血管等疾病的发生密切相关。本实验采用c DNA末端快速扩增法克隆草鱼ROCK1基因全长序列,预测并分析其编码的蛋白,采用实时荧光定量PCR法检测草鱼ROCK1基因的组织差异表达。实验首次克隆获得了草鱼ROCK1基因全序列,长4 604 bp,编码1 361个氨基酸;草鱼ROCK1氨基酸序列与金线鲃、斑马鱼、鲤鱼ROCK1的氨基酸序列同源性分别达95%、94%、94%,同源性较高;草鱼ROCK1蛋白分子量158 035.73,理论等电点5.69,为亲水性非分泌蛋白,无信号肽;其二级结构包括α-螺旋（α-helix）、β-重叠（β-strand）和环（loop）。组织差异表达显示草鱼ROCK1基因在各组织中均有表达,其中在脑和血液中表达量最高（p〈0.05）,其次为鳃、心脏、肾脏、脾脏和前肠组织,肌肉和肝脏组织表达量较低,皮肤组织表达量最低,所得结果将为后续研究草鱼组织纤维化奠定基础。

瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动。本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0~200 Hz)刺激0~24 h后Egr-1基因表达量的变化。结果显示:瘤背石磺Egr-1基因c DNA序列全长2556 bp,含134 bp的5’端非编码区、709 bp的3’端非编码区和1713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸。瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有琢螺旋和茁折叠。瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P<0.05)。相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P<0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据。

草鱼phd基因分子克隆、序列分析及杜仲对其表达的影响

脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase,PHD)是胶原合成的关键酶,在维持胶原三螺旋结构稳定性中起着重要作用。为探究草鱼phd基因在草鱼不同组织中的表达水平及其在胶原合成方面的作用,本实验通过RACE技术获得phd 2175 bp cDNA全序列,包含1074 bp开放阅读框,编码358个氨基酸,168 bp的5′-末端非翻译区和933 bp的3′-末端非翻译区。PHD蛋白分子质量为39.773 kDa,无信号肽,无跨膜区,为亲水性蛋白质。同源性比对发现,草鱼PHD氨基酸序列与其他鱼类PHD氨基酸同源性较高,尤其与团头鲂的相似性高达95.17%,进化分析结果也显示草鱼与团头鲂的亲缘关系最近,与人、老鼠、牛的亲缘关系最远。组织表达水平结果显示,phd在草鱼前肠中表达量最高,其次是在脑、肾、血、心脏,在肝、鳃、肌肉、皮肤中也有一定的表达量,而在脾脏中表达量最低。饲料中添加2%杜仲,能显著促进第4、8周时草鱼phd在草鱼肌肉、皮肤、心脏、前肠等组织中的表达。本研究结果可为进一步研究脯氨酸羟化酶在鱼类胶原蛋白形成过程中的作用提供科学依据。