血清学检测的雄性特异性抗原Fab抗体的特异性鉴定

旨在研究血清学检测的雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的特异性。以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有较高雄性特异性结合活性的重组噬菌体克隆为基础,构建Fab抗体的可溶性表达噬质粒,并诱导和纯化该抗体片段,利用免疫荧光FITC/DAPI共染技术和ELISA分析其特异性。结果表明,该抗体在约49 ku处有条带出现。在Fab抗体和H-Y抗血清的细胞免疫荧光比较分析试验中发现,从雌、雄鼠脾细胞的阳性细胞数量和平均荧光强度的角度分析,Fab抗体的雄性特异性强于抗血清。石蜡切片免疫荧光定量分析显示,Fab抗体与雄鼠肝脏的结合活性明显高于对应雌鼠,差异极显著(t=20.73,P=0.002 3<0.01),而H-Y抗血清与雄鼠肝脏的结合活性略高于对应雌鼠,差异显著(t=7.11,P=0.019 2<0.05)。以C57BL/6雄鼠脾细胞、睾丸细胞作为抗原的ELISA分析显示,Fab抗体具有雄性特异性,但Fab抗体的OD值低于抗血清。结果提示,Fab抗体的雄性特异性高于H-Y抗血清,但其雄性特异性结合活性低于H-Y抗血清,Fab抗体在具备雄性特异性的同时,仍有少量雌性非特异性结合,Fab抗体的体外亲和力成熟可作为后续研究工作,以获得高亲和力、高雄性特异性的可溶性Fab抗体分子。

Kif18A的SUMO化修饰及其调控机制

目的：探讨Kif18A的 SUMO化修饰及其调控机制。方法在 HEK293T 细胞中共转染Flag－Kif18A、HA －SUMO1或 His －SUMO1质粒，免疫沉淀富集Flag －Kif18A，免疫印迹检测HA －SUMO；用 TALON 树脂富集His－SUMO1蛋白，免疫印迹检测Flag －Kif18A考察Kif18A的 SUMO化水平。利用 SUMOsp 2．0软件预测Kif18A可能发生 SUMO化的潜在位点，将 Flag－Kif18A 质粒中的相应位点上的编码序列由Lys突变成 Arg，在HEK293T 细胞中表达突变体后再检测Kif18A的SUMO化水平的变化来确定Kif18A的 SUMO化位点。通过在HEK293T 细胞中共染转Flag －Kif18A、HA －SUMO1以及 SENP1野生型（WT）或SENP1酶活位点突变型（Mut）质粒，再采用免疫沉淀和免疫印迹检测Kif18A的SUMO化水平，来证明 SENP1是 Kif18A 的去 SUMO化蛋白酶。最后，用Nocodazole处理 HeLa 细胞，使其同步化在G2／M阶段，再考察G2／M期HeLa细胞中Kif18A的SUMO化水平。结果Kif18A 能被SUMO1或者 SUMO2修饰，K47和K148是Kif18A发生SUMO化的两个主要位点，SENP1催化Kif18A的去 SUMO化修饰。 HeLa细胞同步化在 G2／M期后，Kif18A的 SUMO化水平显著下降。结论Kif18A能发生SUMO化修饰，且其SUMO化受到细胞有丝分裂进程的调控。