酶体外定向进化(Ⅲ)展示技术及其应用

利用展示技术构建的蛋白质/多肽的突变体库,可以通过高通量进行高效地分析和筛选,因此特别适用于改造蛋白质.文中综述噬菌体、细胞表面、核糖体、mRNA等展示技术的原理和方法,以及其在酶定向进化中的应用.

酶体外定向进化(Ⅱ) 文库筛选的方法及其应用

定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略,但其构建的文库非常大,待筛选的克隆常常多达105～1010.同时在目的酶筛选中,至关重要的是找到高灵敏度、高选择性和高通量的筛选方法.居于此,文中综合评述在突变株分离、酶检测和信号探测等方面,目前的一些常用技术及其最新进展.

甘油脱水酶和二醇脱水酶β亚基生物信息学分析

依赖辅酶B12的甘油脱水酶和二醇脱水酶是同工酶。它们不仅氨基酸序列和蛋白质折叠方式非常相似,而且有着相同的催化机制。该文在同一菌株中将编码甘油脱水酶β亚基基因和编码二醇脱水酶β亚基基因片段分别克隆至T载体,从而获得两段核苷酸片段序列,将pddB序列提交Genbank数据库,获登陆号为DQ483052。同时结合PDB数据库中甘油脱水酶和二醇脱水酶的晶体结构,该文用生物信息学方法对所测序列进行了初步分析,并对两种同工酶的β亚基对脱水酶与辅酶的亲和力进行了比较。

来源于克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶的同源建模

用Swiss-Model和Modeller对来源于Klebsiella pneumonide的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)进行三级结构建模,并对所得的6个目标模型进行评价和比较,从中选择最好的一个模型,预测了辅酶NADP+和Fe2+在PDOR结构空间的近似位置,并定位了与NADP+和Fe2+作用的相关残基。

依赖辅酶B12的甘油脱水酶生物信息学分析

用生物信息学的方法对依赖辅酶B_(12)型甘油脱水酶的各个亚基结构进行了分析,并对其功能进行了探讨。通过对底物未结合时与底物结合后的酶分子构象变化进行分析,探讨了底物的结合对各个亚基的影响。

重组PDOR基因的表达与纯化及部分酶学性质

将dhaT在E.coliBL21(DE3)pLysS中进行表达,并对含有His6标记的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)进行纯化.重组PDOR反应的最适pH值为10.0,最适温度为55℃,其以1,3-丙二醇和NAD+为底物的表观米氏常数Km值分别是15.5,0.23 mmol.L-1.实验表明,Ca2+,Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,而Fe2+,Na+,NH4+和Mn2+对酶活性有促进作用;1,3-丙二醇是PDOR适合的氧化底物.