人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性

目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。

重组人血管内皮细胞因子VEGF183刺激HUVEC体外增殖

VEGF183为VEGF-A基因一个拼接异构体,因其蛋白序列与VEGF189高度同源,导致其功能研究被忽视,所以目前VEGF183功能仍需进一步研究。本研究通过毕赤酵母表达并用琼脂糖肝素亲和层析方法获得重组人VEGF183蛋白,MTT法研究VEGF183蛋白在体外对HUVEC增殖刺激能力,并分别与VEGF165、VEGF189的相应活性作对比。Transwell与划痕实验分别研究其对HUVEC的迁移能力,Miles assay研究其对大鼠血管通透能力,并与VEGF189的相应活性作对比。结果发现,VEGF183仍保留对HUVEC增殖和迁移的刺激能力,但弱于VEGF165,强于VEGF189。此外,VEGF183拥有强于VEGF189的刺激血管通透能力。本研究结果提示VEGF183可能为实现血管生成过程中精确调控的一个异构体。