弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断

首次建立弓形虫人株(ZS_2株)基因组文库,筛选出一个弓形虫特异DNA片段的克隆。对该克隆的DNA片段(1.1kb)进行了限制性内切酶图谱分析。应用Southern印迹法及斑点印迹法检测,结果示同位素^(32)P标记的该克隆DNA片段能与弓形虫DNA、人工感染弓形虫幼猪白细胞和胸腺DNA、弓形虫感染病人DNA杂交,但不与正常人、正常幼猪外周血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、肺孢子虫、pBR322的DNA杂交。斑点杂交检测低限为100个弓形虫或500pg弓形虫DNA。该探针已成功地应用于多种弓形虫感染病例的检测,为弓形虫病提供了一个特异、灵敏的DNA诊断方法。

用多聚酶链反应诊断弓形虫病

根据本实验室筛选出的弓形虫(ZS_2株)特异DNA克隆片段的部分顺序分析的数据,设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立多聚酶链反应诊断弓形虫病的方法。不同来源的弓形虫株和7例畸形胎儿DNA经体外基因扩增,扩增产物经电泳检测,均出现特异的扩增条带。对42例肝炎综合症的婴儿和33例不良生育史的孕妇的外周血白细胞DNA检测,分别为6例和4例阳性。50例正常人外周血白细胞DNA检测均为阴性。对扩增产物进行Southern印迹分析,以^(32)P标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,能与阳性病例特异的扩增条带杂交,而不与阴性样品的扩增产物杂交。本法并与其它检测方法的结果相比较,具高度特异、敏感且快速的优点。

特异弓形虫DNA顺序的克隆及用于弓形体病的检测

弓形体病是一种人畜共染性疾病,它对免疫抑制的患者常易致命。孕妇一旦被弓形虫感染,可通过母婴垂直传播,造成胎儿畸形或死胎。

弓形虫cDNA文库的构建

目的：建立弓形虫ｃＤＮＡ文库。方法：用异硫氰酸胍酸性一步法提取弓形虫（ＲＨ株）ＲＮＡ，含ＰｏｌｙＵ的ｍＲＮＡ亲和膜分离Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ，进而合成双链ｃＤＮＡ。将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ接头连接，再与表达载体λｇｔ１１ＤＮＡ臂连接，经体外包装，感染大肠杆菌Ｙ１０９０。以３２ｐ标记的弓形虫ＲＨ株基因组ＤＮＡ为探针，对重组噬菌斑进行原位杂交。结果：ｃＤＮＡ产物分布在０．５－２ｋｂ，得到６．９７×１０５重组子，重组率为９８．７３％，克隆效率为６．９７×１０６克隆／μｇｃＤＮＡ。噬菌斑原位杂交的阳性斑点占重组克隆９５．２％。结论：用异硫氰酸胍酸性一步法提取弓形虫ＲＮＡ简便有效，已建立了一个容量大、质量好的弓形虫ｃＤＮＡ文库。

弓形虫的分子生物学研究

弓形虫的分子生物学研究上海第二医科大学生化教研室分子生物学实验室夏爱娣综述陈诗书审校弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）是寄生于人和多种动物组织细胞内的原虫。人群弓形虫感染抗体阳性率英国２０－４０％，美国５０－６０％，法国８０－９０％［２］，我...

弓形虫特异DNA片段顺序分析及体外基因扩增

从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出了一个弓形虫特异DNA片段的克隆,对克隆的片段进行了部分顺序分析。根据所得DNA顺序,自行设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立了体外扩增弓形虫特异DNA顺序的聚合酶链反应(PCR)方法。4种不同来源的弓形虫株DNA、人工感染弓形虫的三头幼猪白细胞和胸腺DNA经过PCR扩增,均出现特异的扩增条带;而正常人、正常幼猪外围血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、溶组织内阿米巴和人巨细胞病毒DNA均不出现特异的扩增条带。对扩增产物进行了Southern印迹和限制性内切酶图谱分析,证明该PCR产物是弓形虫DNA特异的顺序。该方法可测出少至1pg的弓形虫DNA或1个弓形虫体的裂解液。本文分析的DNA顺序和设计合成的引物顺序数据,经电脑DNA数据库检索,证明无相同的顺序。本方法并具有简便、快速等优点,便于推广应用。

生物化学教学中现代教学媒体的应用

应用多媒体课件和VCD，激发学生学习的兴趣和主动性．提高了应用法语进行生物化学课程教学的效果。

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、C57BL/6小鼠H-2KbcDNA及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3,体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达。将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化。在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果:LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3∶1(μg∶μg),转染效率达30%。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2KbcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显示有57kDaH-2Kb蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/106细胞。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+的数量治疗组较对照组高,?

弓形虫感染对围产儿致畸致病的影响

本文报告用免疫学和分子生物学方法对28例畸形儿产妇,10例畸形儿及其母亲,75例婴儿肝炎综合征进行弓形虫检测。23例产妇血清弓形虫抗体阳性率48%,10例畸形儿母亲血清抗体阳性率90%,而畸形儿弓形虫DNA杂交及动物接种分离弓形虫阳性率分别为70%和80%。婴儿肝炎综合征血清抗体阳性率9.8%,上述阳性率均显著高于正常人群弓形虫血清抗体阳性率。说明弓形虫感染是导致胎儿致畸及婴儿肝炎综合征的重要病原之一。

弓形虫感染的防治与优生

弓形虫是一种细胞内寄生虫,妊娠期感染对胎儿可产生多种不良后果。文章收集正常早孕103例及异常生育史妇女368例,分别采用间接血凝试验(IHA),间接荧光抗体试验(IFA)测定,正常早孕组IHA阳性占5.8%;异常生育史组为33.9%。另外对33例不良分娩史孕妇作DNA杂交试验,7例阳性。100例作酶联免疫吸附试验(ELISA-IgM),2例阳性。研究资料表明具早期诊断的价值,故早孕期作弓形虫感染血清学筛查,对优生工作有重要意义。

多媒体在生物化学教学中的应用

目的介绍多媒体课件和网络资源进行生化的教学。方法 利用网络资源丰富教学内容并制作多媒体课件,使教学直观,易于理解。结果 多媒体课件使枯燥、深奥的内容得以形象演示,图文并茂,产生动态效果;提高了教学效果。结论 多媒体课件的使用提高了生化教学的效果,网络的发展也为生化教学提供了丰富的资源。

弓形虫人源、畜源分离株的生化特性研究

本文采用弓形虫特异ＤＮＡ探针杂交技术，聚丙烯酰胺电泳，免疫印迹试验，色质谱分析对弓形虫人源分离的ＳＨ、Ｚｓ２株，猪源分离的ＣＮ，ＰＰ株，兔源ＲＴ株等１１个分离株在核酸、蛋白质、脂肪酸方面与国际标准人株ＲＨ株进行分子生化特性的比较与分析，实验结果表明用３２Ｐ标记弓形虫ＤＮＡ探针（１．１Ｋｂ）能与各虫株ＤＮＡ杂交，在２．０Ｋｂ位点上显示出明显的杂交带；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳蛋白质分子量范围在１－１２０ＫＤ间，以１４、１８、２２、３０、３５、３７、４１、４３、５２、７６ＫＤ为各虫株共有的条带，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，各虫株在３０、５２、７６ＫＤ均能被抗弓形虫ＩｇＧ识别；有机质谱仪检测脂肪酸组分中各虫株均有６种主要脂肪酸组成（ｃ１４一Ｃ１８）分别为肉豆蔻酸、棕榈油酸、软脂酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其中油酸和软脂酸占总脂肪酸含量的７０％，各虫株相对含量有所差异。实验结果为弓形虫分离株的生化特性和鉴定工作提供了科学理论依据。

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体，用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ，并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物，观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性，转染效率为１０％左右，瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用，ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。

EGR-1启动子在肿瘤基因治疗中的应用

ＥＧＲ－１的启动子为早期生长反应因子－１基因上游约－５５０～０ｂｐ的一顺式作用元件，其活性受控于一些诱导剂，如电离辐射。联合ＥＧＲ－１的启动子与治疗基因（如ＴＮＦ－ａ、自杀基因），用辐射能在肿瘤局部从时、空调控治疗基因的表达，使其产物局限于肿瘤局部，并发挥放疗的杀肿瘤效应，而放疗与转基因产物又有协同作用。放射治疗与基因治疗的配伍为肿瘤的治疗提供了新思路。

转铁蛋白增强脂质体介导基因对肝癌细胞的转染和表达

目的：检测转铁蛋白能否增强脂持体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表达。方法：应用本滓验室构建的含小 鼠一细胞介素（ｍｌＬ）－１２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ ｍＩＬ－１２和绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ ＥＧＦＰ， 观察转铁蛋白增强阳离子脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导上述两种质粒ＤＮＡ对小鼠和不同人肝癌细胞株的转染及 表达效率。结果：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ加转铁蛋白介导ｐｃＤＮＡ３／ＥＧＲＰ对小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐｌ－６的转染效率由２％－ ５％提高至２０％，对４种不同人肝癌细胞株的转染效率由１５％。提高至６５％～７５％；但对小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５ＴＬｉ 的转染效率并不增加。转铁蛋白可使ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导ｐｃＤＮＡ３ｍＩＬ－１２在Ｈｅｐｌ－６中的表达量增强１８倍。结论： 转铁蛋白能够与ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ和质粒ＤＮＡ形成复合物，显著增强脂质体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表 达，但对不同种肝癌细肥株的增强效率不同。

TORCH与优生：Ⅲ用聚合酶链反应结合地高辛分子杂交产前诊断弓形虫感染

根据本实验室筛选出的弓形虫（ＺＳ２株）特异ＤＮＡ克隆片段的部分顺序分析的数据，设计并合成特异的寡核苷酸引物对，建立多聚酶链反应（ＰＣＲ）诊断弓形虫感染的方法。不同来源弓形虫株和阳性标本ＤＮＡ的ＰＣＲ产物经电泳检测，均出现特异的扩增片段。以地高辛标记的该ＰＣＲ产物中弓形虫特异顺序的寡核苷酸为探针，对扩增产物进行斑点杂交分析，该探针能与阳性病例的扩增产物杂交，而不与阴性病例的扩增产物杂交。用ＰＣＲ结合地高辛分子杂交方法对不良生育史孕妇进行产前诊断，３４例外周血白细胞ＤＮＡ检测，２例阳性，分别为出生水肿胎儿和死胎；７６例羊水细胞ＤＮＡ检测，３例阳性，其中２例出生为无脑儿；３０例绒毛ＤＮＡ检测，４例阳性，均为难免流产。ＰＣＲ产物结合地高辛分子杂交方法可测出少至１０ｆｇ（１０－１４ｇ）的弓形虫ＤＮＡ，本方法更加特异敏感。

基因修饰人肝癌和胃癌“瘤苗”及实验性肿瘤联合基因治疗

恶性肿瘤基因治疗的临床研究已有10余年,但疗效尚未确定.治疗策略也不下十余种,但何种策略为佳尚无定论.目前采用的策略多数为单一基因治疗,而肿瘤的发生可能涉及多种基因及多种因素,发病过程也是多步骤的.本研究建立一种细胞因子基因工程人肝癌和胃癌细胞"瘤苗",用于经手术切除的肝癌或胃癌患者,消灭微小残存癌细胞,并预防复发转移;或用于无手术指征的患者或手术后复发患者的辅助性治疗措施.探索多种基因及因素的配合进行实验性肿瘤的联合基因治疗研究.首先克隆一系列的治疗基因,构建不同载体及调控元件;然后进行不同基因的联合治疗作用,并与放射治疗相结合;最后还筛选新的肿瘤治疗候选基因,旨在为临床提供更有效的肿瘤基因治疗策略和方案.

阳离子脂质体用作基因转移载体的研究进展

鉴于阳离子脂质体制备简便、安全无毒、无免疫原性,近年来在基因转移方面得到了广泛应用.为了更好地适用于体内基因治疗,目前正致力于研制高效、稳定、靶向的阳离子脂质体.

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目 的 研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子、CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达。 方法 利用CMV启动子、ECR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP、pcDNA3-EGR-GFP重组质粒,经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株,对脂质体转染条件进行优化,在最佳转染条件下,分别给予不同浓度H2O2、不同剂量γ射线处理转染细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪(FACS)检测GFP的表达情况。 结果FACS检测显示氧自由基、电离辐射可诱导EGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达,而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达。 结论EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性。

实验性肿瘤的联合基因治疗研究

恶性肿瘤基因治疗的临床研究已有10余年,但疗效尚未确定.治疗策略也不下12种,但何种策略为佳尚无定论.目前采用的策略多数为单一基因治疗,鉴于肿瘤的发生可能涉及多种基因及多种因素,发病过程也是多步骤的,该研究探索多种基因及因素的配合进行实验性肿瘤的联合基因治疗研究.首先克隆一系列的治疗基因,构建不同载体及调控原件,然后进行不同基因的联合治疗作用,并与放射治疗相结合,最后还筛选新的肿瘤治疗候选基因,旨在为临床提供更有效的肿瘤基因治疗策略和方案.