基于免疫信息学技术的雏沙门菌多表位疫苗构建

【目的】设计针对雏沙门菌(Salmonella Pullorum)IpaJ蛋白的多表位疫苗(multi-epitope vaccine, MEV),为净化鸡白痢提供新的疫苗。【方法】选用IEDB预测雏沙门菌IpaJ蛋白的T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)类分子结合表位;用NetMHCIIpan 4.0 Server预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位;用IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出的表位经过VaxiJen v 2.0评估抗原性后,将合格的表位通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力,使用免疫模拟评估多表位疫苗的免疫效果,最后优化密码子便于克隆表达。【结果】经筛选后,选择4个MHCⅠ、4个MHCⅡ和8个B淋巴细胞表位优势表位构建的多表位疫苗MEV-IpaJ。多表位疫苗MEV-IpaJ的分子质量为28.18 ku,为稳定亲水蛋白,具有良好的抗原性,存在4个潜在的N-糖基化位点,α-螺旋、延长链、β-转角和无规则卷曲分别占20.38%、19.23%、8.08%和52.31%。三级结构Ramachandran作图显示,优势区域中含有残基数占89.9%%,进行细化后优势区域的残基数增加到94.0%,三级结构突出表位作图也证明MEV-IpaJ具有良好的免疫原性。分子对接结果显示,MEV-IpaJ与Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)和TLR4蛋白分子可对接。免疫模拟结果显示,MEV-IpaJ具有较好的免疫应答,能提高部分细胞因子的表达,经密码子优化确保设计的MEV-IpaJ可在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定地表达。【结论】本研究构建的多表位疫苗MEV-IpaJ可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为雏沙门菌多表位疫苗的设计提供了一种新的方法,为雏沙门菌多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。

蛋鸡养殖中新城疫危害及防控措施

近年,蛋鸡养殖业发展迅速,疫病的发生是困扰其发展的关键因素,新城疫(Newcastle disease,ND)则是制约其健康发展的重要疫病之一。新城疫是危害家禽养殖最重要的传染病之一,在全球范围内流行,传染性强、病死率高。该文详细阐述蛋鸡养殖中新城疫的危害,并提出应对措施,以帮助蛋鸡养殖户科学防控新城疫。

白细胞介素-2在牛感染性疾病中的作用

白细胞介素-2(IL-2)是Th1型细胞因子家族中重要的成员之一,主要由CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞产生,具有促进T细胞增殖的作用,同时还具有调节B细胞、NK细胞及巨噬细胞等的功能。IL-2的生成是机体受微生物感染时免疫应答的一部分,以区别“自己”与“非己”,其在牛结核病、牛传染性鼻气管炎、口蹄疫、布鲁菌病、巴氏杆菌病、白血病等感染性疾病中发挥重要的作用。深入了解牛IL-2的结构、功能及其在感染性疾病中的作用机制,有利于对牛IL-2的进一步的研究和应用。

结核分枝杆菌在动物中的流行与传播

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种重要的人兽共患病病原菌,人类是其主要宿主。千百年来,由于动物与人类关系密切,动物也成为结核分枝杆菌的重要宿主,且感染结核分枝杆菌的动物还能成为传染源,将其传播至人类和其他动物。关于动物感染结核分枝杆菌已有大量报道,包括大象、非人灵长类动物、貘、海狮、犬、猫、牛、鸟等。本文就结核分枝杆菌在野生动物、家畜中的流行与传播进行介绍,总结其在动物间传播的主要途径。

牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒的研制与评价

目的研制一种牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒,并在奶牛结核病检疫中进行初步应用和评价。方法建立牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测方法,基于此法试制3批试剂盒,并对试剂盒的灵敏度、可重复性和保存期进行评价,其后进行初步应用,对961头奶牛采用单纯颈部皮试变态反应、商品化BOVIGAMTM试剂盒与试制的牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒进行同步检测。结果该试剂盒对质控样品的最低检出量达到8.21ng/mL,而且检测重复性良好,试剂盒保存期达12个月以上。在进行临床试验时,试制的试剂盒与单纯颈部皮试变态反应相比,阳性一致率为70.59%,阴性一致率为99.20%,总一致率为98.44%;与BOVIGAMTM试剂盒相比,阳性一致率为91.30%,阴性一致率为99.78%,总一致率为99.58%。其灵敏度为85.00%,特异性为100.00%。结论成功建立牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测方法,并研制出相应试剂盒,具有良好应用前景。

人类传染病亦危害动物健康

随着畜牧业发展、宠物市场增长、气候变化、生态系统破坏以及旅行和商业全球化,人与动物之间的关系在全球范围内持续加强。人类与动物之间的联系不断升级,使得病原体的威胁也不断扩散。关于人兽共患疾病的研究多集中在由动物传染给人类的疾病,如疯牛病、艾滋病、禽流感等。但是微生物的交换是相互的,近年来越来越多的研究表明人类亦会将病原体传播给动物,包括新型冠状病毒、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲型流感病毒、隐孢子虫和蛔虫等。因此本文对人类疾病传染给动物的研究作一综述,为人与动物传染病的有效预防与控制提供参考。

ELISPOT检测技术在结核病诊断中的应用

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌复合群所引起的一种人兽共患传染病,关于结核病的防治,难题之一依然是诊断问题。酶联免疫斑点试验是在酶联免疫吸附试验的基础上发展的一种检测技术,能够在单细胞水平上定量检测低频细胞亚群,具有高灵敏度、高特异性和高通量等特点,在肿瘤疫苗评价试验、免疫监测及免疫学研究中发挥重要作用。目前,该检测技术在结核病诊断中已实现临床检验,并且已有商品化的T-SPOT.TB试剂盒应用于人结核病诊断。本文对ELISPOT检测技术在结核病诊断中的应用作一综述。

牛肿瘤坏死因子α小鼠单克隆抗体的制备

目的制备抗牛肿瘤坏死因子α(BoTNF-α)的单克隆抗体(mAb)。方法以原核系统表达的带有组蛋白(His)标签的重组牛TNF-α蛋白(rHis-BoTNF-α)为免疫原,带有谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的重组牛TNF-α蛋白(rGST-BoTNF-α)为检测原,采用杂交瘤细胞技术制备mAb。Western blot法检测mAb与rHis-BoTNF-α和rGST-BoTNF-α的反应性,间接ELISA检测mAb效价、特异性以及mAb与商品化重组BoTNF-α的反应性,流式细胞术分析mAb识别天然抗原的活性。结果成功筛选出7株稳定分泌抗rBoTNF-αmAb的杂交瘤细胞株。结果证明7株mAb均具有良好的反应性及特异性。流式细胞术分析显示mAb 4G4具有良好的识别天然抗原的活性。结论成功制备了抗BoTNF-α的mAb。

结核分枝杆菌靶向宿主细胞蛋白逃逸免疫杀伤的研究进展

结核分枝杆菌是引发结核病的一种人兽共患病原菌,严重危害人类健康以及公共安全,作为一种兼性胞内感染菌,其引发结核病的关键是破坏宿主免疫防御机制以提高其在胞内生存能力。结核分枝杆菌感染宿主细胞的过程中,分枝杆菌效应蛋白通过与宿主靶蛋白的相互作用来影响细胞凋亡、炎性因子表达、抗原提呈等多种免疫效应,从而逃逸宿主细胞的杀伤,并在机体免疫状态低下时复发从而引起结核病。深入了解结核分枝杆菌效应蛋白和宿主靶蛋白的相互作用及分子机制,将为结核病的防治提供新的线索。

牛干扰素诱导蛋白-10单克隆抗体的制备及其流式检测方法的建立

为制备针对牛干扰素诱导蛋白-10(BoIP-10)的高亲和力单克隆抗体(MAb),并建立基于胞内染色技术的BoIP-10流式检测方法,本研究以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIP-10为免疫原,使用纯化的rGST-BoIP-10为筛选抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选针对BoIP-10的MAb,结果显示,筛选获得8株稳定分泌BoIP-10 MAb的细胞株,分别为3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8和3A12;通过间接ELISA鉴定MAbs与真核BoIP-10的反应性,结果显示2A5、2D5、2H8等3株MAb与毕赤酵母表达的BoIP-10有较好的反应性;进一步采用阻断ELISA方法评价MAbs是否结合血浆中的天然BoIP-10,结果表明MAb 2D5可以识别血浆中的天然BoIP-10。将MAbs进行荧光标记后建立BoIP-10流式检测方法,结果显示建立的BoIP-10流式检测方法最佳刺激剂为ConA,最优刺激浓度为20μg/mL,最佳MAb株为2D5,MAb的最优使用浓度为4μg/mL。采用该BoIP-10流式方法检测BCG诱导牛外周血单核细胞Bo IP-10的表达水平,结果显示BCG体外感染牛外周血单核细胞12 h时表达较高水平的Bo IP-10。本研究制备并筛选出针对天然Bo IP-10的特异性MAb 2D5,基于此建立的流式检测方法为进一步研究Bo IP-10在牛机体免疫应答评价、牛结核病等传染性动物疫病诊断中的应用提供新的技术手段。

流式细胞术在牛疫病诊断中的应用

近年来,我国畜牧业发展迅速,其中养牛产业规模更是不断扩大,肉牛和奶牛及其相关产品的生产水平不断提高,推动了我国畜牧业的快速发展。但牛结核病、乳腺炎等多种疾病的不断传播给养殖者造成严重的经济损失。开发这些牛疫病的早期诊断方法有助于减少疾病的传播,降低经济损失。流式细胞术(FCM)是以流式细胞仪为检测工具的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。该技术在疾病的早期诊断中发挥了重要的作用。针对流式细胞术在牛疫病诊断中的应用进行了综述,为解决牛疫病传播提供了参考。

牛分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的制备及其竞争ELISA方法的建立与应用

【背景】牛结核病是一种重要的人兽共患传染病,主要由牛分枝杆菌引起,阻碍养殖业发展,并在世界范围内造成巨大经济负担。【目的】制备牛结核分枝杆菌CFP-10蛋白单克隆抗体,建立牛结核病竞争ELISA方法并对其进行初步应用与评估。【方法】以rHis-CFP-10蛋白作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,选用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,并对其纯化后进行辣根过氧化物酶标记。基于CFP-10单克隆抗体建立牛结核病竞争ELISA方法,对155头奶牛采用商品化BOVIGAMTM试剂盒与建立的竞争ELISA检测方法进行同步检测,验证该方法适用性。【结果】获得一株稳定分泌CFP-10特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株8E6,获得酶标抗体HRP-8E6并建立竞争ELISA方法。棋盘法确定包被抗原CFP-10-ESAT-6融合蛋白的工作浓度和酶标抗体HRP-8E6的稀释倍数分别为0.75μg/mL和1:8000,该方法Cut-off值为47.10%,检测限为0.800μg/mL;其重复性良好,批间与批内试验变异系数均小于10%;敏感性为54.55%,特异性为100.00%。临床检测显示,与BOVIGAMTM试剂盒相比,阳性符合率为78.57%,阴性符合率为82.35%,总符合率为80.65%。【结论】制备一株CFP-10特异性抗体,并使用特异性高的CFP-10-ESAT-6融合蛋白建立竞争ELISA检测方法,该方法准确、可靠,可应用于牛结核病的检测。

一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法

本研究旨在建立一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法。对前期制备并筛选出的针对牛细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10和MCP-1的单克隆抗体进行荧光标记,与细胞表面分子抗体组合搭配,进行牛多细胞因子流式检测方法的建立和优化。随后利用建立的方法进行BCG体外感染牛外周血单个核细胞的细胞因子表达规律测定,并结合CFP10-ESAT6蛋白刺激剂评价上述细胞因子作为牛结核诊断标识的潜力。建立的牛多细胞因子流式检测方法可以有效测定BCG感染牛外周血T淋巴细胞的细胞因子表达,其中IFN-γ、IL-2、TNF-α在感染40h后持续上升,而IP-10和MCP-1表达水平呈现下降趋势;对于牛外周血CD4^(+)T淋巴细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α的联合检测能有效区分牛结核阳性和阴性样品。这一方法为牛病原菌感染、疫苗注射后细胞免疫应答水平评价以及疫病诊断提供了重要技术手段。

牛分枝杆菌Mb0950c的免疫特性及其血清学检测方法的建立

【目的】利用原核表达系统对牛分枝杆菌Mb0950c蛋白进行表达和纯化,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病的临床检测。【方法】构建pET32a-Mb0950c原核表达质粒,并转化至BL21(DE3)中诱导蛋白的表达,对蛋白进行纯化。使用流式细胞术(flow cytometry,FCM)、ELISA等对该蛋白在小鼠中的免疫原性进行分析。建立基于Mb0950c的间接ELISA方法,评价该方法的临床检测潜力。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,成功获得了可溶性Mb0950c蛋白,且具有良好免疫反应性;FCM结果显示,Mb0950c蛋白上调了T细胞表面CD69分子的表达。细胞因子和抗体结果表明,该蛋白能够诱导特异性的IFN-γ和IL-4的分泌,同时能诱导机体分泌特异性的抗体,且以IgG1型为主。建立了ELISA检测方法应用于牛结核临床检测,结果显示,该方法与牛结核外周血IFN-γ外释放试验和皮试试验结果的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为65.7%、97.9%和72.4%。【结论】在原核表达系统中可溶性表达Mb0950c蛋白,它在小鼠模型中诱导Th1和Th2型免疫应答,基于此蛋白建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。

布鲁菌抗原蛋白的原核表达、纯化与鉴定

PCR扩增布鲁菌rplL、groEL、bp26、omp25、p39、sod1基因,构建pET-28a(+)-rplL、pCold I-groEL、pCold I-bp26、pCold I-omp25、pCold I-p39、pCold I-sod1原核表达质粒,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况,免疫亲和纯化目的蛋白。结果表明:PCR分别扩增出375、1 641、753、642、1 206和522bp的目的片段,重组菌诱导后分别表达大小为20、65、33、28、47和24ku的重组蛋白,与目的蛋白理论大小相符。Western blot结果显示6种重组蛋白均能与His单抗发生特异性反应,表明6种重组蛋白具有良好的免疫反应性,为进一步深入研究奠定了基础。