类鼻疽菌通过诱导线粒体自噬促进其胞内存活的研究

目的探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响。方法类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2 h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线粒体膜电位的变化,全波长酶标仪检测感染后各时间点ATP含量变化;同时,通过Western blot和实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)分别检测感染后各时间点线粒体蛋白HSP60、TIM23和线粒体DNA mtCO1的变化,激光共聚焦显微镜观察线粒体与自噬小体共定位的情况;最后,分别通过线粒体自噬诱导剂CCCP和抑制剂Mdivi-1预处理后,检测各感染时间点胞内细菌载量的变化。结果类鼻疽菌感染THP-1细胞后2 h观察到宿主细胞线粒体超微结构受损,线粒体膜电位和ATP含量在各感染时间点均降低(P<0.01),且呈时间递减趋势,提示类鼻疽菌感染后线粒体结构和功能受损;Western blot检测显示HSP60和TIM23蛋白水平随感染时间延长而减少,同时Q-PCR检测也显示mtCO1基因水平随感染时间延长而减少,免疫荧光分析显示线粒体蛋白TIM23与自噬小体GFP-LC3共定位明显增多(P<0.01),提示类鼻疽菌感染后诱导了线粒体自噬的发生;使用线粒体自噬诱导剂CCCP以及抑制剂Mdivi-1处理细胞后,与对照组比较,激活线粒体自噬类鼻疽菌胞内细菌载量增多(P<0.05),而抑制线粒体自噬其胞内细菌载量降低(P<0.05)。结论类鼻疽菌感染THP-1细胞后引起宿主细胞线粒体结构和功能受损进而诱导线粒体自噬的发生,从而有利于类鼻疽菌的胞内存活。

类鼻疽杆菌Ⅵ型分泌系统蛋白Hcp1的重组表达及免疫学性质鉴定

目的重组表达类鼻疽杆菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulated protein 1,Hcp1),并对其免疫学性质进行鉴定。方法利用DNA重组技术以pET-28a表达系统在E.coli BL21(DE3)中重组表达Hcp1;通过亲和层析制备高纯度Hcp1蛋白;采用腹腔注射免疫小鼠制备抗Hcp1血清,ELISA检测抗体滴度,免疫印迹及免疫荧光分析抗体的免疫反应性。结果成功获得纯度达95%的重组Hcp1蛋白,该蛋白免疫小鼠后获得的抗血清具有较好的特异性和较高的抗体滴度(1∶512000),表现出良好的免疫原性和免疫反应性。结论成功制备了具有生物学活性的Hcp1重组蛋白及其抗血清。

1例复发类鼻疽的病原学鉴定及生物学特性研究

目的通过对1例复发类鼻疽进行系统病原学鉴定及生物学特性研究,分析和探讨类鼻疽菌长期滞留机体可能的适应宿主机制。方法对临床收集的来源于同一个患者时隔5年分离到的两株类鼻疽菌,进行微生物学鉴定、全基因组测序,并使用相关软件对测序数据进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、同源比对进化树、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)以及插入缺失(insertion-deletion,Indel)分析;进一步在感染肺上皮A549细胞模型中比较感染不同时间细胞内细菌载量变化;双向电泳-质谱技术分析两株细菌在蛋白水平的表达变化。结果分离到的两株类鼻疽菌,全基因组均约7.12 Mb,COG功能注释编码蛋白大致约5 000个;MLST分型均为ST58型;同源比对进化树分析显示它们位于同一分支且与其他分离自中国的类鼻疽菌亲缘关系较近;SNP/Indel分析显示复发株有114个SNP位点、55个Indel位点;与原发株相比,双向电泳-质谱结果表明复发株共有68个蛋白的表达水平发生了显著的变化;同时复发株感染A549后细胞内细菌载量明显增加(P<0.05)。结论以上复发菌株的基因组学、蛋白组学以及胞内感染增殖能力的系统研究提示类鼻疽菌可能在机体长期的选择压力下微进化,通过对细菌基因转录表达、分泌系统、耐药以及能量代谢等方面的调控更加适应其在宿主体内的生存而实现长期滞留。

线粒体自噬在感染性疾病中的作用机制研究进展

线粒体自噬作为一种选择性自噬方式是近年研究的热点。细胞通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体,从而维持其功能稳态。近年来,越来越多的研究聚焦于病原体通过胁迫线粒体自噬在机体感染过程中调节先天免疫信号通路,从而影响感染性疾病的进程。本文分别从线粒体自噬在病毒、细菌和真菌感染性疾病中的作用机制研究进展进行综述,以期为感染性疾病的防治提供新的指导策略。