大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。

葛根素对SD大鼠全身炎症反应综合征的治疗作用及其机制研究

目的建立全身炎症反应综合征(SIRS)SD大鼠模型,探讨葛根素对SIRS的治疗效果及其作用机制。方法采用腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液制备SD大鼠SIRS模型。通过SIRS大鼠静脉注射葛根素后动物死亡率变化,了解葛根素治疗SD大鼠SIRS的效果。采用ELISA定量检测试剂盒,测定葛根素对SIRS大鼠外周血肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)水平的变化。结果注射剂量分别为750mg/kg和1000mg/kg酵母多糖-石蜡悬液时,均可诱导大鼠发生SIRS。腹腔注射1000mg/kg酵母多糖-石蜡悬液后48h,大鼠的死亡率为73.3%,但同时再静脉注射62.5mg/kg葛根素后死亡率可降至20.0%(P【0.01)。腹腔注射750mg/kg酵母多糖-石蜡悬液后24h和48h,大鼠外周血中TNF-α、IL-6和IL-10浓度分别为(32.89±5.58)pg/ml、(578.20±92.45)pg/ml、(1.35±0.21)ng/ml和(31.57±5.26)pg/ml、(546.15±89.45)pg/ml、(1.31±0.19)ng/ml,静脉注射62.5mg/kg葛根素后24h和48h的TNF-α、IL-6浓度分别降至(16.71±3.75)pg/ml、(385.30±76.34)pg/ml和(15.32±3.41)pg/ml、(363.29±68.59)pg/ml(P【0.01),IL-10浓度升至2.05±0.19ng/ml和2.08±0.20ng/ml(P【0.01)。结论本研究成功地建立了稳定的SIRS大鼠模型。葛根素对SIRS大鼠有良好治疗效果,下调促炎因子TNF-α和IL-6水平、上调抗炎因子IL-10水平可能是葛根素抗SIRS的作用机制之一。

肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性

目的:构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统,探讨CiaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法:采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因,以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量。制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。结果:与报道序列比较,所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%～100%和100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR,其产量分别高达细菌总蛋白的33%和45%。rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶1、1∶1。CiaH-IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR-IgG胞内封闭CiaR后,青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性,但对耐药菌株耐药性无明显影响。结论:成功地构建了肺炎链球菌ciaH/ciaR基因原核表达系统,为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础。CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关。

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。

百日咳鲍特菌外膜蛋白的致病性与免疫原性

百日咳鲍特菌外膜蛋白是存在于细菌表面的一组功能性蛋白质,包括P69、FhaC和BrkA,其中以P69最为重要。P69分子中的RGD-(GGxxP)_5和(PQP)_5两个富含脯氨酸结构区分别具有粘附作用和很强的免疫原性,其抗体具有较强的保护作用,可作为无细胞型百日咳疫苗中的一个重要抗原成分。P69具有多态性,百日咳流行菌株的P69已从P69A转变成以P69B或P69C为主,所引起的抗原性漂移与疫苗预防效果下降有直接关系。FhaC是该菌的一种外膜蛋白,能特异地辅助丝状血凝素分泌;BrkA不仅具有蛋白转运功能,且能抵抗抗体依赖补体介导的细胞毒作用。

甲壳素纤维织品体外抗细菌和癣菌活性的研究

目的 观察甲壳素含量不同的针织布体外抑制或杀灭细菌或癣菌的作用。方法 采用不同细菌或癣菌接种量 (1× 10 6～ 1× 10 2 /mL) ,用体外抑菌试验和杀菌试验检测 10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抗菌作用 ,实验中以普通全棉布作为对照。结果 作为对照的普通全棉布对上述细菌或癣菌无任何抑制作用。与普通全棉布比较 ,10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抑制率 [抑制率 =(每毫升CFU值 每毫升接种量 ) /每毫升CFU值× % ]分别高于普通全棉布的 99.8%～ 99.9%、85 .2 %～ 89.6%和 74.2 %～ 85 .8% ,表明随甲壳素纤维含量逐渐增高 ,抑菌作用逐渐增强 (χ2 ≥ 18.2 5 ,P <0 .0 1)。所有甲壳素纤维织品均未发现有体外杀菌活性。结论 受试的甲壳素纤维织品无体外杀菌活性 ,但均有一定的体外抑制细菌或癣菌作用 ,以 10 0 %甲壳素纤维无纺布抑制作用最强 ,2 0 %甲壳素针织布次之 ,10 %甲壳素针织布较弱。

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。

空肠弯曲菌fliG基因敲除突变株动力、体外趋化和小鼠定植能力的改变

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是人类细菌性胃肠炎的病原体。趋化是细菌向合适的寄生部位定向运动,也是空肠弯曲菌在宿主空肠黏膜表面实现定植的关键起始步骤,该趋化运动由趋化相关二元信号系统(che-TCS)以MCPs→Ches→Flis/Mots方式调控。FliG是Fli蛋白家族成员,一些病原菌的FliG被证明是鞭毛马达蛋白,也是细菌鞭毛马达中开关复合体的必需组分,但空肠弯曲菌FliG在细菌趋化中的作用未明。本研究中,我们根据同源重组原理,构建空肠弯曲菌NCTC11168株fliG基因敲除(fliG-)突变株,然后对fliG-突变株的动力、趋化和定植能力进行测定。动力实验和体外趋化实验结果证实,fliG-突变株在半固体琼脂平板上的菌落直径、在硬琼脂平板上对0.2mol/L脱氧胆酸钠(SDC)的趋化聚集环直径均明显小于野生株(P<0.05)。与野生株比较,黏附于BALB/c-ByJ小鼠空肠黏膜表面以及空肠内容物中的fliG-突变株数量也明显减少(P<0.05)。实验结果表明,fliG是空肠弯曲菌鞭毛动力以及细菌感染时向空肠黏膜趋化运动的必需基因。

肝脏合并肺脏曼氏裂头蚴病1例

内脏型裂头蚴病报道较少,肝脏合并肺脏曼氏裂头蚴病极其罕见。本文报道2021年9月26日浙江大学医学院附属第四医院收治肝脏合并肺脏曼氏裂头蚴病1例患者的诊治经过,为临床诊治内脏型裂头蚴病带来一些新的经验。

七例2019冠状病毒病(COVID-19)普通型患者出院后病毒核酸随访结果

目的:随访研究2019冠状病毒病(COVID-19)患者在达到出院标准后病毒核酸检测结果,为医疗机构对出院患者随访管理提供决策依据。方法:对浙江大学医学院附属第四医院经治疗后已符合出院标准的COVID-19患者采取院内继续隔离观察7 d,再居家隔离4周,期间记录患者每日临床体征,定期送检痰液行病毒核酸检测,评估患者病情变化。结果:已符合现有出院标准的7例患者中有3例在5~7 d后再次出现痰液病毒核酸检测阳性,持续阳性2~6 d后再次转阴;复查患者血常规、C反应蛋白、血生化以及胸部CT结果均无明显异常,也无明显临床症状。其余4例患者随访4周,痰液病毒核酸检测均为阴性,未出现COVID-19相关临床症状,实验室和影像学检查结果无异常。结论:COVID-19患者按现有标准出院后复阳的比例较高,建议有条件的医疗机构对满足现行出院标准的患者继续院内隔离观察7 d并进行连续的病毒核酸监测。

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。

基于常见遗传变异和传统风险因素的中国南方汉族人群结直肠癌风险预测模型研究

目的 基于结直肠癌全基因组关联研究（GWAS）发现的易感位点,联合传统风险因素建立中国南方汉族人群结直肠癌风险预测模型.方法 对1 066例结直肠癌患者和3 880例健康对照的21个GWAS候选位点进行基因分型,分析其与结直肠癌易感性之间的关联.通过遗传风险评分（GRS）和加权遗传风险评分（wGRS）计算显著候选位点的联合效应.以不同方式组合遗传风险评分和传统风险因素,构建结直肠癌风险预测模型,并绘制受试者工作特征曲线评价模型优劣性.结果 7个候选位点与结直肠癌易感性显著相关.随着风险评分的升高,人群患结直肠癌的风险也随之升高（GRS：P=0.002 6,wGRS：P＜0.000 1）,相比于四分位分组中最低一组,GRS和wGRS最高的一组OR值分别为1.33 （95％CI：1.12～1.58,P=0.001 0）和1.76 （95％ CI：1.45 ～ 2.14,P＜0.000 1）.联合传统风险因素和wGRS的模型为最优模型,其曲线下面积为0.593（95％CI：0.573～ 0.613）.结论 结直肠癌易感位点间存在显著的联合作用.相比于传统风险因素模型,传统风险因素结合加权遗传风险评分模型能更好预测结直肠癌的患病风险.

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐药性关系。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段，T—A克隆后测序。构建phoQ和phoP基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rPhoQ和rPhoP，皮内注射免疫法制备兔抗血清，免疫双扩散法测定抗血清效价。采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因，采用PCR、测序和Westernblot对phoQ。突变株进行鉴定。采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗，丰素的最低抑菌浓度（MIC）。结果与GenBank中相关序列比较，所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98．7％一99．6％和98．7～100％、98．4％～99．8％和99．1％～100％。采用pET-42a和E．coliB121DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP。rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1：4和1：8抗血清。经PCR、测序和Westernblot鉴定，两株phoQ^-突变株phoQ基因及产物均缺失。上述phoQ^-突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1／512～1／2048。结论PhoQ／PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统，该系统介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。

16S rDNA多重PCR检测牙周组织感染菌及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系的研究

目的 建立多重 16SrDNAPCR检测慢性牙周炎 (CP)标本中牙龈卟啉单胞菌 (Pg)、伴放线杆菌 (Aa)和齿垢密螺旋体 (Td) ,了解不同感染情况与CP严重程度的关系。方法 将轻、中和重度15 2例CP患者牙周袋标本和 30名牙周健康者龈沟标本置于 2 0 0 μl裂解缓冲液中 ,10 0℃水浴 10min后取 10 μl上清液作为聚合酶链反应 (PCR)模板。常规酚 氯仿法提取的PgATCC332 77株、AaY4株、TdFM株和E .coliDH5α株DNA分别作为PCR阳性和阴性对照。采用Pg、Aa和Td 16SrDNA特异性引物 ,建立多重PCR检测上述标本。 3例Pg、Aa和TdPCR结果均阳性标本的目的扩增片段T A克隆后测序。采用 χ2 检验分析不同混合感染情况与牙周炎严重程度之间的关系。结果所建立的多重 16SrDNAPCR最低可检出 10个Pg、2 0个Aa和 2 0个Td细胞。Pg、Aa和Td 16SrDNA扩增片段与已报道的序列比较 ,相似性分别高达 99.4 5 %、97.0 8%和 96 .5 9%。 30名牙周健康者龈沟标本中 ,仅有 1名Pg(3.3% )、2名Aa(6 .7% )的 16SrDNA扩增结果阳性 ,其余标本均阴性。 15 2例CP患者牙周袋标本中 ,14 7例 (96 .7% )检出Pg、Aa和 /或Td的 16SrDNA ,5例 (3.3% )扩增结果均阴性。Pg的PCR检测阳性率 (91.5 % ,139 15 2 )明显高于Aa(72 .4 % ,110 15 2 )或Td(80 .9% ,12 3

4742例门诊女性阴道微生态分布情况分析

回顾本地区阴道微生态分布情况并得出一些结论。方法 收集2021年6月至2022年5月我院门诊就诊的4742例女性的阴道微生态结果资料并进行回顾性分析,进而探讨其与年龄和季节之间的关系。结果 ① 4742例就诊者中,菌群正常者1403例,占29.59%,菌群异常者3339例,占70.41%。菌群异常者中,单纯性阴道炎1299例,占38.90%,混合性阴道炎1229例,占36.81%,菌群抑制142例,占4.25%,微生态失调669例,占20.03%。其次是占21.81%的AV+BV+VVC。②按年龄。年龄≥51岁阴道微生态菌群异常者比例最高,占87.36%,其次是年龄≤20岁,占77.31%。单纯性阴道炎中,BV感染在五个年龄组中占比均为最高,其次为VVC;BV感染比例随着年龄增长而上升,最高的为年龄≥51岁组,占71.70%;VVC感染比例最高的为年龄21~30岁组,占41.36%。混合性阴道炎中,五个组均以AV+BV为主,感染比例最高的为年龄≥51岁组,占75.86%。③按季节。秋季菌群异常者比例最高,占73.73%,其次为夏季,占72.96%。混合性阴道炎比例以夏季最高,占29.63%。单纯性阴道炎中,BV感染比例春季最高,占74.35%,夏季最低,占39.32%;VVC感染比例夏季最高,占46.10%,其次为秋季,占45.68%。结论 女性最易感单纯性阴道炎,其中BV最多,VVC其次。混合性感染主要是AV+BV。年龄≥51岁的女性更容易阴道菌群异常。女性在春季易患BV,在夏和秋季易患VVC。阴道炎治疗过程中要结合患者年龄、发病季节和阴道微生态的状况,针对性地使用药物。利用阴道菌群移植作为治疗阴道炎的潜在方法并积极进行女性健康宣教。

抑郁症与焦虑症患者发作期血清同型半胱氨酸的水平研究

分析抑郁症与焦虑症患者发作期血清同型半胱氨酸(HCY)水平,研究其在抑郁症、焦虑症患者临床诊断中的意义。方法:选择2016年5月-2021年12月收治于我院并确诊的200例抑郁症、198例双相情感障碍、200例焦虑症患者以及200例健康志愿者,将患者组记作研究组,健康志愿者记作对照组,用酶速率法检测血清HCY,比较两组成员体内血清HCY的浓度。结果:研究组患者中血清HCY水平明显高于于对照组(P<0.05)。研究组男性患者中,抑郁发作组与焦虑症组、双相抑郁发作组与焦虑症组,血清HCY水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:抑郁发作、焦虑发作会引起血清HCY水平明显增高,高HCY水平可能是引起精神疾病症状的重要因素之一,HCY可以作为诊断抑郁发作的潜在生物标志物。