不同菌草对皿培牛樟芝菌丝体的影响

以香茅草、忧遁草、巨菌草、象草和紫色象草5种菌草(Juncao)为试材,采用菌草浸出液进行皿培牛樟芝菌丝体的方法,研究了菌丝体生长速率、三萜、氨基酸、胞外酶活性、三萜合成途径中关键基因表达,以期筛选出促进牛樟芝菌丝体生长和活性物质积累的培养基,为今后解决牛樟芝人工培养成本高、耗时长等问题提供参考依据。结果表明:香茅草与忧遁草浸出液能显著促进牛樟芝菌丝体的生长,培养时间较对照组缩短12 d;不同菌草浸出液对牛樟芝菌丝体总三萜含量促进作用依次为香茅草>巨菌草>忧遁草>紫色象草>象草,与对照组均有显著性差异;香茅草浸出液显著促进漆酶、谷氨酸合成酶合成,显著促进AcHMGS、AcHMGR和AcSE表达。香茅草浸出液能作为牛樟芝菌丝体培养基,促进菌丝体生长和三萜含量积累。

牛樟芝不同发育阶段菌丝体实时荧光定量PCR中内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术具有较高的敏感性、准确性和特异性,被广泛应用于基因表达分析。在基因表达分析中,选择合适的内参基因是衡量样品表达量和准确性的重要前提和保障。本研究以液体发酵7、21、35 d的牛樟芝菌丝体为样本,采用qRT-PCR技术检测牛樟芝菌丝体内Actin、TPK、Floxuridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2-helicase、MAGT1等8个候选内参基因在3组样本中的表达水平,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper3个软件对其分别进行稳定性比较和评价。结果表明,geNorm软件计算得出Floxuridine、HA2-helicase、TPK、CAP-Gly在牛樟芝菌丝体中具有更高的稳定性;NormFinder软件计算得出TPK、CAP-Gly、Floxuridine、HA2-helicase在牛樟芝菌丝体中具有较高的稳定性;BestKeeper软件计算得出HA2-helicase的表达水平最好,其次是TPK和MAGT1。综合分析结果认为TPK和HA2-helicase比其他内参基因更稳定,更适合作为牛樟芝菌丝体研究的内参基因。可见,通过牛樟芝菌丝体转录组数据来筛选和挖掘稳定表达的内参基因具有可靠性、高效性和可行性,为牛樟芝菌丝体基因表达分析提供了可靠的内参基因。

牛樟芝菌丝体全长cDNA文库构建及EST序列分析

目的为了更好地挖掘牛樟芝Antrodiacinnamomea菌丝体三萜合成和代谢相关基因、筛选互作蛋白和牛樟芝指纹图谱分析,构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库并分析其表达序列标签(EST)序列。方法以牛樟芝菌丝体为材料,采用Gateway法构建其cDNA文库,对部分EST序列进行生物信息学分析、功能注释和EST-SSR分析。结果成功构建了牛樟芝菌丝体cDNA文库,经鉴定文库重组率高达95%,文库滴度为6.1×106 cfu/mL,总克隆数为1.2×107 cfu,插入片段大小为300~2000 bp,平均长度达1000 bp。随机挑选单克隆进行测序获得65个有效EST序列,其中1个重叠群,64个单一序列,比对结果显示有45条序列有明确功能注释,18条为未知功能基因,GO功能注释结果表明序列涉及细胞组成、转运、催化活性、调控等功能。所有EST序列共含有271个SSR,牛樟芝核苷酸重复类型丰富,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元占总重复基元的94.23%。结论初步明确牛樟芝菌丝体cDNA文库及其EST序列相关生物信息,为牛樟芝菌丝体基因组学研究奠定理论基础。