大鼠肾脏三肽基肽酶Ⅰ物理化学性质和氨基酸顺序分析

为进一步探讨三肽基肽酶Ⅰ(TripeptidylpeptidaseI,TPPI)的物理化性质和酶的动力学特征,通过SP 琼脂糖凝胶(SP sepharose),Phenyl cellulofine,ResorceS,超葡聚糖凝胶(SuperdexG 75)柱层析的方法,提纯大鼠肾脏三肽基肽酶Ⅰ并测定它的分子量、理化性质、酶的动力学参数及N 末端氨基酸顺序.经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定后,得到了单一区带.提纯倍率约为8000倍.用SDS PAGE时,β 巯基乙醇(β ME)不存在和存在下,其分子量为43kD和46kD.用非变性 PAGA时,其分子量为280kD.在pH2.2～10.5范围内,TPPI具有水解Ala Ala Phe MCA的活性.该酶对于Ala Ala Phe MCA的最适pH值为3.5～4.5.在最适pH4.0条件下,对Ala Ala Phe MCA底物的Km、Vmax、Kcat和Kcat Km值分别是:680μmol L,3.7mmol (g·min),33.1 s和4.87×104 (s·mol).TPPI能被对氯汞苯甲酸盐(PCMBS)和HgCl2强烈地抑制,被二异丙基氟磷酸酯(DFP)中等程度地抑制.TPPI是受巯基试剂调节的丝氨酸酶.

猪精浆液中磷脂酰乙醇胺结合蛋白4的纯化及其一级结构分析

目的:从猪精浆中纯化磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的一个新成员——猪磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(sus PEBP4),为进一步研究其功能奠定理论基础。方法:利用饱和硫酸铵盐析、Q-Sepharose、Matrex Gel RedA、SP-XL-Sepharose和FPLC Mono-S(A)柱层析从500mL猪精浆中纯化susPEBP4,自动氨基酸测序仪进行N-末端氨基酸测序及内部序列分析。生物信息学方法分析其与人、牛和狗的序列同源性。结果:经SDS-PAGE电泳分离鉴定得到了相对分子质量为25000的单一区带的sus PEBP4。生物信息学方法分析显示,其与人、牛和狗之间氨基酸序列同源性为75.2%～81.8%之间。结论:从猪精浆中制备了电泳纯的PEBPs家族的新成员sus PEBP4,明确了其一级结构,生物信息学分析显示其与其他生物体氨基酸同源性高。

大鼠三肽基肽酶Ⅰ对肾素-血管紧张素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的水解作用

目的探讨大鼠三肽基肽酶Ⅰ(TPPⅠ)的生物学活性,特别是对具有生物学活性小肽降解的作用机制。方法用反相高效液相层析及飞行质谱仪,在体外分析了大鼠TPPⅠ对肾素-血管紧张素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等小肽的水解作用。结果大鼠TPPⅠ能不同程度地降解肾素-血管紧张素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的N-末端而释放出三肽。并且,水解肾素-血管紧张素Ⅲ的速度远远大于人工合成基质Ala-Ala-Phe-MCA的速度,其水解速度的大小顺序为:肾素-血管紧张素Ⅲ>Ala-Ala-Phe-MCA>肾素-血管紧张素Ⅱ>肾素-血管紧张素I。结论肾素-血管紧张素Ⅲ是TPPⅠ的良好天然基质。