非洲猪瘟EP364R蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1毒株的EP364R基因序列(GenBank登录号:FR682468.1)合成EP364R基因序列,通过PCR技术扩增目的基因EP364R,并克隆到pET-32a(+)载体,成功构建了重组质粒pET-32a-EP364R,鉴定正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的pET-32a-EP364R重组蛋白为诊断抗原,成功建立了检测ASFV的间接ELISA抗体检测方法。将建立的间接ELISA检测方法与法国ID-Vet非洲猪瘟抗体试剂盒分别对临床84份血清进行检测,总符合率达89.3%,表明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。为ASFV的快速诊断、流行病学调查和血清学抗体检测提供了快速实用的检测手段。

非洲猪瘟病毒p72/p32蛋白的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立与比较

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的间接ELISA方法,试验基于p72/p32基因序列,构建了重组质粒pCold-p72/p32,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,利用Ni柱亲和层析法纯化p72/p32重组蛋白,并以此为包被抗原建立2种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并对方法的临界值、有无交叉反应、重复性及敏感性进行了检测,并对来自不同猪场的临床样本进行验证性检测。结果表明:试验成功构建了重组质粒pCold-p72/p32,2种重组蛋白均能与ASFV阳性血清反应;p32以可溶性蛋白和包涵体蛋白形式表达,p72以包涵体蛋白形式表达。基于p32重组蛋白所建立的间接ELISA方法的临界值为0.543,基于p72重组蛋白所建立的间接ELISA方法的临界值为0.612;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%;与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等常见病原的阳性血清无交叉反应;与商品化的非洲猪瘟抗体试剂盒检测结果的符合率分别为95.1%和91.3%。说明试验建立的2种间接ELISA方法均具有良好的特异性、敏感性和重复性。通过比较,可以初步认为以p32重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测效果更好,可以用于猪血清样本中ASFV抗体的检测。

非洲猪瘟MGF360-11L蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)HLJ/2018株(GenBank登录号:MK333180)MGF360-11L核苷酸序列,合成MGF360-11L基因序列,将其克隆至pET-32a(+)载体。测序正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的MGF360-11L重组蛋白作为包被抗原,建立了检测ASFV MGF360-11L抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法与法国ID-Vet非洲猪瘟抗体检测试剂盒分别对192份临床血清样品进行检测比较,结果显示,该间接ELISA方法的特异性为91.6%,敏感性为92.1%,符合率约为91.7%。表明,该间接ELISA方法敏感性高、重复性好和特异性强,可初步用于临床血清样品非洲猪瘟抗体的检测,该方法的建立为ASFV的快速诊断提供了更多选择,对非洲猪瘟的防控提供了技术支持。

基于非洲猪瘟病毒B119L蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为了建立一种针对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的血清学检测手段,参考ASFV Pig/HLJ/2018株全基因组序列合成非结构蛋白B119L的基因序列,成功构建重组表达质粒pCold-Ⅰ-B119L,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达获得重组蛋白,利用纯化后的B119L重组蛋白作为诊断抗原,建立检测ASFV抗体的间接ELISA检测方法。结果显示:原核表达的B119L蛋白的分子质量为14.4 ku,与预期相符;以其为包被抗原建立的间接ELISA检测方法的批间及批内变异系数均小于10%;标准阳性血清的最低检测稀释度为1︰5120;对ASFV阳性血清具有特异性,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒阳性血清无交叉反应;该间接ELISA方法与商品化试剂盒的符合率为100%。本研究中建立的间接ELISA检测方法特异性、重复性、灵敏度良好,为ASFV的临床检测和流行病学调查提供了依据,对于预防ASFV的感染具有重要作用。