基因编辑与诊断工具酶LwCas13a的克隆表达、纯化与酶活性鉴定

目的开发可大量制备具有天然酶活性的基因编辑与诊断工具酶LwCas13a的技术,为研究基因编辑或开发基因诊断试剂提供稳定的酶。方法以LwCas13a蛋白基因序列为模板,采用PCR技术扩增目的基因LwCas13a,运用NotⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将酶切产物与相同酶切获得的载体pC013用T4 DNA连接酶连接构建成含有融合表达His标签的原核表达载体pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a,选择经酶切和测序鉴定均正确的质粒转化到E.coli BL21感受态细胞中,用0.5 mmol·L^(-1)的异丙基-β-D-硫代丰乳糖苷在16℃条件下诱导16 h,表达LwCas13a酶,产物经SDS-PAGE电泳检测,获得可溶性表达条件后,进行大量蛋白诱导表达,使用Ni^(2+)亲和层析法,纯化LwCas13a蛋白。利用LwCas13a酶的“侧向切割活性”检测纯化获得的酶。结果PCR扩增获得3479 bp序列完全正确的LwCas13a基因,重组蛋白以融合蛋白形式可溶性高效表达,纯度达到98%。经比较优于商业化的LwCas13a酶。结论成功获得具有天然侧向剪切活性的LwCas13a酶,为开发使用LwCas13a酶的分子诊断试剂提供原材料奠定了基础。