单增李斯特菌sRNA00111缺失株构建及对细菌部分生物表型的影响

为了研究sRNA00111对单增李斯特菌的毒力、抗应激能力及生物被膜形成等方面的影响,采用同源重组技术,融合目的基因同源臂构建载体后,在高温和氯霉素条件下连续传代筛选缺失株。分析标准株和缺失株在环境应激反应、毒力及生物被膜方面的影响。结果显示,成功构建基因缺失菌株LM-ΔsRNA00111;与标准株相比,缺失株LM-ΔsRNA00111在不同温度环境下生长曲线无明显差异,表明sRNA00111基因表达不受温度影响;在pH为5.5和9.5的环境下培养,缺失株生长速度均低于标准株,表明该基因在酸性和碱性环境应激中对菌体生长有减缓作用。生物被膜试验表明缺失株形成能力略高于标准株。黏附和侵袭试验可知,缺失株对于Caco-2细胞的侵袭能力明显低于标准株。对靶基因分析,sRNA00111参与并调控了碳代谢和毒力代谢相关的靶基因。综上表明,sRNA00111基因在应激环境条件下,对单增李斯特菌的碳代谢及毒力具有重要的调控作用。

甘肃河西地区肉羊肌肉和肝肾组织中抗菌药物残留的检测

为筛选和调查甘肃省河西地区羊肉产品中抗微生物药物残留类别,测定与分析其残留现状,以河西地区4个市肉羊可食组织(肌肉、肝、肾)为研究对象,利用兽药残留检测试纸条初步筛查7大类28种抗微生物药物残留类别和种类,再以液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定初筛阳性样品中药物残留量,并进行统计学分析。初筛结果显示,129份样品中7类抗微生物药物阳性检出率44.19%;肌肉、肝、肾检出率分别为6/39(15.38%)、47/51(92.16%)、4/39(10.26%);结合当地常用兽药确定了喹诺酮类(恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素)、大环内酯类(泰乐菌素、替米考星)3类6种抗微生物药物。LC-MS/MS测定结果显示,检出药物类别与初筛结果一致;肌肉和肝中替米考星检出率最高,平均残留量分别为1.5633μg/kg、14.5187μg/kg,肾中庆大霉素残留量最高,达到133.2138μg/kg;6种抗微生物药物检出率差异不显著(P>0.05);肌肉、肝、肾中3类组织中药物检出率差异显著(P<0.05);酒泉、张掖、金昌3地肉羊产品以庆大霉素检出率最高(27.27%、33.33%、16.67%),武威肉羊产品以泰乐菌素和替米考星检出最为突出(33.33%),但4市之间差异不显著(P>0.05);恩诺沙星、环丙沙星、替米考星及泰乐菌素残留量符合GB 31650,合格率为100%;2份肌肉样品庆大霉素残留量超标,合格率为98.45%;20份样品检出的氧氟沙星,为食品动物禁用药物,合格率为84.50%。研究结果可为羊肉食品中兽药残留监测、筛选和精准识别提供科学依据,为确保羊肉质量安全提供数据支持。

羊肉组织中6种抗微生物药物残留检测的HPLC-MS/MS方法建立

【目的】为了对羊肉及其副产品中抗微生物药物残留进行快速痕量检测,优化检测技术,建立羊可食组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。【方法】对0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇2种不同药物提取液进行了对比;以动物性食品中氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类药物检测国家标准为参考,比较HLB和C_(18)2种固相萃取柱对6种目标药物的净化效果;同时,分别用0.1%甲酸水、乙腈、0.1%甲酸乙腈、甲醇、0.1%甲酸甲醇作为洗脱液对提取净化后的样品进行洗脱,对比交叉组合的提取和洗脱效果。将建立方法应用于实际样品检测,并与国家标准检测方法进行对比和统计分析。【结果】确定了以0.1%甲酸乙腈提取30 min,HLB固相萃取柱净化,0.1%甲酸甲醇洗脱时,恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素6种药物质谱信息捕捉准确,色谱分离效果良好,在限定浓度范围内标准曲线回归系数R2均大于0.99,在5、20、50μg/kg 3个加标浓度下回收率为73.3%~114.0%,相对标准偏差(n=6)1.01%~13.01%。6种药物在羊3种可食组织中检出限(LOD)0.05~1.2μg/kg,定量限(LOQ)0.16~3.8μg/kg,均低于现行国家标准中规定的该类药物残留检出限。单因素方差分析结果显示,方法与国家标准检测方法在检测结果上差异不显著(P>0.05)。【结论】建立了羊可食组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素药物残留检测的高效液相色谱串联质谱法,该方法灵敏、准确、高效,可为羊肉及其副产品中抗微生物药物残留监测、筛选和精准识别提供技术支撑。

猫细小病毒LZ-01株的分离鉴定及其VP2基因克隆和序列分析

为了解猫细小病毒(FPV)在甘肃兰州地区的流行情况,将胶体金试纸条检测FPV阳性的粪便样品接种F81细胞,进行病毒分离鉴定,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,对分离的FPV进行VP2基因的克隆和测序,并与国内外参考株进行同源性比较及遗传进化分析。结果显示,分离得到1株FPV,命名为FPV/LZ-01,其接种F81细胞可引起特异性的细胞病变,从出现细胞病变的F81细胞中提取病毒基因组DNA,用鉴定通用引物进行PCR鉴定,扩增出约为392 bp特异性基因条带;间接免疫荧光试验表明,FPV/LZ-01分离株接种到F81细胞48 h后可观察到特异性绿色荧光;序列比对结果显示,FPV/LZ-01分离株的VP2基因序列与22株国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.2%~99.9%;进化树分析显示,FPV/LZ-01分离株与Beijing-01株(MK266797.1)亲缘关系最近,处于同一分支,与其他参考株遗传距离相对较远。研究结果丰富了我国FPV的流行病学资料,为进一步研发FPV疫苗提供了候选毒株。

单增李斯特菌生物被膜形成不同时段sRNA的筛选

为了筛选与单增李斯特菌(LM)生物被膜形成相关的非编码小RNA(sRNA),并初步探索sRNA及其靶基因生物学功能,本研究通过高通量测序和实时荧光定量PCR比较LM浮游菌和生物被膜形成不同时段sRNA的差异情况,筛选与LM生物被膜形成相关的sRNA;预测sRNA的靶基因及分析其可能参与生物被膜形成的调节通路。结果表明:与LM浮游菌相比,预测到38个新的sRNA,其中sRNA00085、sRNA00019、sRNA00058在LM生物被膜形成中显著上调,sRNA00054、sRNA00081、sRNA00111显著下调;3个上调sRNA和3个下调sRNA的靶基因可能参与碳代谢、不同环境中微生物代谢、核糖体、糖代谢、氨酰基-tRNA生物合成及脂肪酸代谢6条调控通路,是潜在的LM生物被膜调控因子。研究结果为深入研究LM生物被膜sRNA调控机制提供了理论依据。

单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种世界范围内的食源性病原菌,食用被该菌污染的食物会引起李斯特菌病,致死率高达20%~30%。单增李斯特菌广泛存在于环境、食品、人和动物宿主中,可以在极端条件下生存并引起食物污染,已成为人们关注的重要公共卫生问题。论文主要综述了近年来国内外几种关于单增李斯特菌的快速检测方法,包括免疫学方法、分子生物学方法、生物传感器技术等,并比较其优缺点,以期为单增李斯特菌的快速检测提供参考。

甘肃省畜禽肉品中单核细胞增生李斯特菌污染情况的调查

采集甘肃省兰州市、定西市、张掖市、酒泉市和庆阳市等地区部分屠宰场和农贸市场共1387份样品。通过常规细菌学和分子鉴定方法对样品进行单核细胞增生李斯特菌分离鉴定,并对分离菌株的耐药性、血清型以及生物被膜形成能力进行测定。1387份样品中共分离出14株单核细胞增生李斯特菌,总分离率为1.0%。选择12种抗菌药物进行纸片扩散法(KB)药敏性检测,结果表明分离菌株对四环素和头孢噻吩耐受最严重,耐药率为100%。青霉素、乙酰螺旋霉素、复方新诺明、红霉素、磷霉素和多黏菌素,多重耐药严重。血清型鉴定结果表明1/2a血清型菌5株(35.7%),1/2b血清型菌2株(14.3%)1/2c血清菌6株(42.9%),4b血清型菌1株(7.1%)。同时,分离株均能形成生物被膜,其中1/2a、1/2b和1/2c血清型菌株形成生物被膜的能力较强。研究表明,甘肃省畜禽肉品中存在单核细胞增生李斯特菌污染,农贸市场中污染最严重,相关部门应加强监控,从而预防食源性疾病的发生。

单增李斯特菌内化素基因inlG基因原核表达及小鼠免疫保护性分析

为研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)内化素基因inlG编码蛋白的免疫原性和免疫保护效果,以标准株ATCC19111菌株基因组为模板,参照GenBank上inlG基因序列设计特异性引物,运用PCR方法扩增inlG基因,构建重组质粒pET-28a(+)-InlG,将其转化至表达菌BL21(DE3),加IPTG后优化表达条件进行SDS-PAGE分析,Western blot分析抗原性。接着将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后皮下注射小鼠,免疫后测定效价,以单增李斯特菌进行攻毒试验,统计小鼠存活率来研究对小鼠的免疫保护效果。结果:扩增出inlG基因全长约为1 473 bp,inlG基因编码490个氨基酸;成功构建重组质粒且表达出相对分子质量约70 ku的蛋白,目的蛋白在上清中表达量较好;Western blot结果表明InlG蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白免疫小鼠后小鼠效价达到1∶52 000以上,具有良好的免疫原性;用2倍半数致死量的LM菌液腹腔感染小鼠,免疫蛋白组小鼠死亡一半,小鼠存活率远远高于未免疫组(6.25%),表明InlG蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。本研究为进一步探讨inlG基因生物学功能奠定基础。

1株跨种裂解李氏杆菌噬菌体的分离鉴定

本研究旨在获得天然李氏杆菌噬菌体,提供防治李氏杆菌病新型生物制剂,减少抗微生物药物的使用,抑制病原菌耐药性的产生。利用产单核细胞李氏杆菌作为宿主菌对屠宰场污水进行双层琼脂平板法筛选,获得噬菌体,并对其进行透射电镜观察、生长特性检测(温度、pH、一步生长曲线、最佳感染复数、有机溶剂影响)、基因组酶切鉴定和全基因组测序分析。分离出的产单核细胞李氏杆菌噬菌体中,选取1株裂解性强,遗传稳定的噬菌体进行后续试验,并命名为LP8;经电镜观察为肌尾科噬菌体,可以跨种裂解18株产单核细胞李氏杆菌和5株威尔斯李氏杆菌,确定LP8的最佳感染复数为1、最适生长温度为45℃、最适pH为7;在6种有机溶剂中,仅异戊醇可导致LP8活性丧失;对提取的基因组进行酶切鉴定,确定为双链DNA;LP8全基因组测序结果表明,基因组大小为87038 bp、含有120个编码基因、编码基因的累计长度为76326 bp、编码基因的平均长度为636 bp、编码区域长度占基因组的比例为87.69%。本试验分离出产单核细胞李氏杆菌噬菌体,并对其噬菌能力和应用价值进行鉴定。分离出的LP8噬菌体相较于李氏杆菌的噬菌体,细菌裂解能力更强,适应环境范围更广。本研究为实验室后续建立产单核细胞李氏杆菌噬菌体库和产单核细胞李氏杆菌噬菌体的其他应用提供了良好的基础。

不同培养条件对单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成的影响

本文以单核细胞增生李斯特菌为研究对象,利用试管培养法、载玻片培养法和微孔板定量法测定不同培养条件下该菌生物被膜的形成情况,研究在不同培养时间、温度、培养基浓度、pH值、NaCl浓度和葡萄糖浓度下对其生物被膜形成的影响。结果显示,培养6~24 h有少量细菌初始附着和微菌落形成,24 h后出现成熟致密的生物被膜,微菌落连成网状结构,48~72 h生物被膜聚集叠加,形成复杂的团状结构;37℃、100%BHI培养基、p H 7.5、5.0 g/L NaCl和22.0 g/L葡萄糖为单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成的最适条件。本研究结果表明,外界培养条件对单核细胞增生李斯特菌生物被膜的形成能力有显著影响,这为有效控制该菌生物被膜形成的研究提供了理论依据。