杨氏柠檬酸杆菌磷脂酶A1基因在E.coli中的表达

为实现磷脂酶A1(PLA1)的异源表达,将杨氏柠檬酸杆菌(CICC No.21596)PLA1基因插入载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET28a(+)-pla1,并将重组质粒转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,获得重组菌p ET28a(+)-pla1/DE3。在IPTG诱导作用下经SDS-PAGE检测,发现在重组菌发酵破碎上清液中存在33 000大小的蛋白质,与预期蛋白质大小相符。在硼砂卵黄平板上对重组菌PLA1活性进行检测,结果显示重组菌具有明显的PLA1活性,表明PLA1基因在大肠杆菌中得到了表达。经发酵初步优化,获得摇瓶发酵的最佳诱导表达条件为:转接体积分数4%、诱导时机2 h、IPTG终浓度为0.4 mmol/L、37℃诱导培养8 h。经酸碱滴定法测得最高酶活为(5.6±0.2)U/m L。

非布司他的合成工艺

以4-异丁氧基间苯二甲酸二甲酯(SM)为原料,经胺解生成4-异丁氧基间苯二甲酰胺(2),2脱水生成4-异丁氧基间苯二甲腈(3),2步收率87.9%。中间体3和硫代乙酰胺加成后,与氯乙酰乙酸乙酯环合生成2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯(5),5经碱性水解后酸化得到非布司他(1),总收率54.9%(以SM计)。该工艺简化了1的合成路线,减少氰化物等剧毒品的使用,反应条件温和,适合1的工业化生产。