基于drop-off ddPCR方法检测急性髓系白血病C-KIT基因N822位点突变及其临床应用

目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值。方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing, NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测。结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54℃,空白检测限为1.62拷贝数/μL,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好。140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4%),而ddPCR共检出突变7例(5.0%),突变频率为0.29%~7.41%;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1%),等位基因频率为1.26%~8.00%。动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0。结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导。

Drop-off微滴式数字PCR检测急性髓系白血病NRAS基因突变及其临床应用

目的:建立检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)基因突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价该方法的临床应用价值。方法:针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证。应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)进行验证。结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158%,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在140例初诊AML患者中,drop-off ddPCR检出NRAS突变28例(20%),其突变负荷为0.26%~52.85%(中位2.14%);而Sanger测序仅检出7例(5%)阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop-off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%~1.50%(中位1.10%)。结论:建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测。

56例巨幼细胞性贫血临床实验室特点分析

目的分析巨幼细胞性贫血(megaloblastic anemia,MA)患者的临床及实验室指标并探讨其临床意义。方法对56例巨幼细胞性贫血患者的临床和肝功能、心肌酶谱、血象和血清造血原料等实验室指标进行回顾性分析。结果 56例患者中48例(85.7%)维生素B12缺乏、5例(8.9%)叶酸缺乏;51例(91.1%)出现贫血伴白细胞和(或)血小板减少,31例(55%)平均红细胞体积(MCV)大于120fL;与正常对照相比,MA患者中乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和间接胆红素(IBIL)明显增高,差异有高度显著性(P<0.01)。结论 LDH、HBDH、AST、TBIL和IBIL增高可作为巨幼细胞性贫血的临床实验室诊断的重要参考指标。

安徽省小麦品种对白粉病的抗性分析

[目的]明确安徽省正试和预试品种对小麦白粉病的抗性水平。[方法]采用田间人工接种鉴定的方法,连续3年对供试的小麦品种进行了抗性鉴定。[结果]2010年参试品种对白粉病表现高感的品种占30%,中感品种占53%,中抗品种占17%;2011年高感品种占42%,中感品种占47%,中抗品种占11%;2012年表现为高感的品种占11%,中感品种占57%,中抗品种占32%。[结论]为引导育种方向及品种审定提供了理论依据。

高分辨率熔解分析检测急性髓系白血病SRSF2基因突变

目的:应用高分辨率熔解分析(high-resolution melting curve analysis,HRMA)检测急性髓系白血病(AML)患者丝氨酸丰富剪接因子2(SRSF2)基因突变。方法:针对SRSF2基因热点突变位点P95,建立PCR-HRMA方法对140例AML患者骨髓标本进行突变检测及DNA测序验证。结果 :HRMA分析发现140例初诊AML患者中7例(5%)检出SRSF2突变,经测序结果验证为1例P95R杂合子突变、2例P95L杂合子突变和4例P95H杂合子突变;HRMA技术检测SRSF2基因突变的灵敏度为10%;SRSF2基因突变组与非突变组在性别、年龄及血象之间均无显著性差异(P>0.05);AML患者中突变组的总体生存时间(OS)明显短于非突变组(P=0.016)。结论:HRMA分析是一种简便、快速、特异和高通量的SRSF2基因突变筛查技术,SRSF2突变的AML患者预后不良。

慢性髓细胞白血病患者PRAME基因启动子甲基化改变

目的:慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者中黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因启动子区域的甲基化改变其及其临床相关性。方法:应用实时定量甲基化特异性PCR(real-time quantitative methylation-specific PCR,RQ-MSP)技术对55例CML患者及20例对照组骨髓单个核细胞标本的PRAME基因启动子甲基化状态进行检测。结果:28/55例(51%)CML患者出现PRAME启动子低甲基化改变,而20例对照未显示低甲基化,两组差异有显著统计学意义(P<0.001)。PRAME低甲基化与患者血液学相关参数及染色体分组均无相关性。PRAME启动子低甲基化频率随疾病进展而降低,在慢性期、加速期及急变期中分别为48%(22/46)、33%(1/3)及17%(1/6)。结论:PRAME基因低甲基化可能是参与CML发生的早期分子事件之一。

let-7a-3基因表达与急性髓系白血病的相关性

目的:通过检测急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中let-7a-3基因的表达水平,探讨其与临床变量的相关性。方法:应用RQ-PCR方法检测83例初诊AML患者BMMNC中let-7a-3基因表达水平,分析其与患者年龄、性别、血象、诊断分型和7个基因(FLT3-ITD,NPM1,C-KIT,IDH1/IDH2,DNMT3A,C/EBPA and N/K-RAS)突变的关系。结果:20例(24%)AML患者存在着let-7a-3转录本的过表达;let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组在年龄、性别、血象、FAB亚型和突变基因之间均无显著性差异(P>0.05);let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组的总体生存(OS)时间并无显著差异(P>0.05),但在治疗后获得完全缓解的患者中let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组的总体生存时间差异有显著性(P=0.003)。结论:let-7a-3基因过表达是AML中的一个常见分子事件。

等长收缩运动中血浆内啡呔的检测及评价

目的 :观察健康青年人在等长收缩运动 (IE)时血浆内啡肽 (EOPs)的变化。方法 :选择健康自愿受试者 40例 ,男女各 2 0例 ,平均年龄 (2 3 .7± 2 .9)岁 ,研究设置二种模型即主观运动和被动运动。观察指标包括血浆中的亮氨酸脑啡肽 (LEK)、β -内啡呔 (β -END)和强啡呔 (DYN)。结果 :LEK、β -END、DYN在IE中均有不同程度的变化。结论 :在IE中LEK、DYN的变化程度较 β -END明显 (P <0 .0 1)。

用图像引导放射技术对肺癌患者进行放射治疗的效果研究

目的 :探讨用图像引导放射技术对肺癌患者进行放射治疗的临床效果。方法 :对2013年7月~2014年7月期间在我院进行放射性治疗的18例肺癌患者的临床资料进行回顾性研究。将这18例患者随机分为对照组和观察组,每组各有9例患者。对对照组患者进行常规放射治疗,对观察组患者进行图像引导放射治疗。然后,比较两组患者的治疗效果、不良反应的发生率及其对治疗的满意度。结果 :观察组患者治疗的总有效率明显对照组患者,二者相比差异具有显著性(P<0.05)。观察组患者不良反应的发生率明显低于对照组患者,二者相比差异具有显著性(P<0.05)。观察组患者对治疗的满意度明显高于对照组患者,二者相比差异具有显著性(P<0.05)。结论 :用图像引导放射技术对肺癌患者进行放射治疗的效果显著。此疗法值得在临床上推广使用。

多聚酶链反应检测老年人肺炎支原体的研究

目的探讨肺炎支原体(MP)与老年呼吸道感染的关系。方法应用多聚酶链反应(PCR)检测128例急性期老年患者痰和分泌物MP-DNA,其相应血清进行MP-IgM检测。结果128例急性期患者MP-DNA中有81例表达阳性,阳性率为63.28%(81/128),而血清学试验检测阳性率为28.13%(36/128),两者均阳性32例,两者均阴性58例,MP-DNA阳性而MP-IgM阴性38例,PCR法和血清学试验两者阳性符合率为39.51%。结论应用PCR方法检测急性期老年患者MP-DNA较血清学法更敏感,阳性率高。

锥形束CT配准前后的肺癌调强放疗计划的临床研究

目的比较配准前后锥形束CT的肺癌调强放疗计划。方法选择22例肺癌患者为研究对象,患者每周1次CBCT扫描(行治疗前、治疗后扫描),对比校正前后各参数指标。结果 CBCT校正后的PTV体积有优势(P<0.05),其他指标校正前后均相似(P>0.05)。CBCT校正后的双肺平均剂量有优势(P<0.05),而脊髓最大剂量校正前后相似(P>0.05)。CBCT校正前后,双肺V5、V10、V20、V30、V50等指标均相似(P均>0.05)。校正后NTCP随V5、V10、V20升高有降低趋势(P=0.152、0.048、0.000)。结论经CBCT校正后的放疗计划可有效减少NTCP,增加PTV剂量,提高放疗效果,且安全性较高,可提升肺癌的治疗效果。

MDRI基因表达与大肠癌的相关探讨

38例原发大肠癌切除标本以过氧化酶免疫组化方法检测多药耐药基因 (mdrl)表达物P糖蛋白 (Pgp)。Pgp/mdrl阳性表达率为 6 3 .2 % ,其中直肠癌的阳性率为 6 0 % ,结肠癌 6 9.2 %。 2 2例患者同时检测肿瘤组织及正常大肠粘膜Pgp的表达 ,正常粘膜仅 6例阳性 ,肿瘤组织 18例阳性 ,Pgp在大肠癌标本中阳性表达明显升高 (P <0 .0 5 )。而Pgp/mdrl表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小、淋巴结和远处转移无关。

三种检测系统测定血清电解质的方法学对比与评估

目的:对Olympus Au-2700全自动生化分析仪、迅达XD-685电解质分析仪和美国强生VITROS350全自动干式生化仪3种血清电解质(K+,Na+,Cl-)测定方法进行对比与偏差评估。方法:依据美国国家临床实验室标准化委员会EP9-A2文件,每天选取临床标本8份,分别用3种检测系统测定标本K+,Na+,Cl-含量,共测定5天,记录检验结果,检查离散点,计算线性方程和相关系数(r),并对其进行偏倚评估。结果:Olympus Au-2700与VITROS350测K+,Na+,Cl-的r分别为0.999,0.987和0.982,Olympus Au-2700与XD-685测K+,Na+,Cl-的r为0.999,0.983和0.975,VITROS 350与XD-685与测K+,Na+,Cl-的r为0.999,0.987和0.986,三者比较的相关性都较好,临床可接受性评价均未超过CLIA′88允许误差的一半。结论:XD-685,Olympus Au-2700和VITROS350 3种检测系统测定血清电解质K+,Na+,Cl-结果基本一致。同一实验室的检测系统应进行方法对比和偏差评估从而判断其临床可接受性以保证检验结果的可比性。

肿瘤抗原MUC1调节骨髓来源抑制细胞的产生

目的探讨MUC1对骨髓来源抑制细胞(MDSC)产生的影响。方法将过表达MUC1细胞(B16-MUC1)和对照细胞(B16-neo),接种于C57BL/6小鼠皮下,待肿瘤形成后,取骨髓、外周血、腹腔液和脾,通过流式细胞术检测MDSC细胞数量;分离C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞,分别与B16-MUC1和B16-neo细胞共同培养24 h和48 h,通过流式细胞术检测MDSC细胞;采用Transwell小室法分析MUC1对MDSC细胞的趋化作用;流式细胞术检测MDSC细胞中MUC1蛋白表达。结果与接种B16-neo组C57BL/6小鼠相比,B16-MUC1细胞接种组小鼠在腹腔液和外周血中CD11b+GR-1+MDSC细胞含量明显降低(P<0.05);正常C57BL/6小鼠骨髓细胞分别与B16-neo和B16-MUC1细胞分别共同培养24 h和48 h后,与B16-neo细胞共同培养组相比,B16-MUC1细胞共同培养组的CD11b+GR-1+MDSC含量明显减少,具有统计学意义(P<0.01);另外,与B16-neo培养组相比,B16-MUC1细胞共同培养组迁移至滤膜下的MDSC细胞数量增加(P<0.05);骨髓细胞与B16-MUC1细胞共同培养组的MDSC细胞中,MUC1的表达增高。结论 MUC1能够抑制骨髓来源抑制细胞(MDSC)的产生,参与MDSC的募集,并诱导MDSC自身表达MUC1蛋白。

急性髓系白血病患者dapk基因启动子甲基化改变的研究

本研究旨在分析中国人群急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase,DAPK)基因启动子的甲基化状况及其临床相关性。应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对112例AML患者骨髓标本dapk基因甲基化状态进行检测。结果表明:13例对照组均未发生dapk基因启动子甲基化,而112例AML患者中82例(73.2%)发生dapk基因甲基化,dapk基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、AML分型以及染色体异常等结果均无相关性(p>0.05)。结论:dapk基因甲基化是AML中的一个常见分子事件。

大肠癌MDR_1基因表达及临床意义初探

３８例原发大肠癌切除标本以过氧化酶免疫组化方法，检测多药耐药基因（ｍｄｒ１）表达物Ｐ糖蛋白（Ｐｇｐ）。Ｐｇｐ／ｍｄｒ１阳性表达率为６３．２％，其中直肠癌的阳性率为６０％，结肠癌６９％。１１例患者同时检测肿瘤组织及正常大肠粘膜Ｐｇｐ的表达。正常粘膜仅３例阳性，肿瘤组织９例阳性，Ｐｇｐ在肿瘤组织中阳性表达明显增高（Ｐ＜０．０５）。而Ｐｇｐ／ｍｄｒ１表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、大小、Ｄｕｋｅｓ分期。

建立高分辨熔解曲线分析法检测SF3B1基因突变

目的:建立高分辨熔解曲线分析法(high-resolution melting analysis,HRMA),检测骨髓增生异常综合征(my-elodysplastic syndrome,MDS)患者中SF3B1基因的突变。方法:针对SF3B1基因热点突变位点(密码子E622、H662、K666和K700)设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增反应体系,对30例初诊MDS患者的骨髓标本进行PCR扩增,应用HRMA对相应PCR产物进行突变检测,并对HRMA检测结果进行DNA测序验证。结果:HR-MA检测发现2例MDS患者存在异常的熔解曲线,经DNA测序验证1例为K666M杂合子突变,另1例为K700E杂合子突变。所建立的HRMA技术检测SF3B1基因突变的灵敏度为0.05(5%)。结论:成功建立检测SF3B1基因突变的HRMA技术,可快速筛查MDS标本中的SF3B1基因突变。

慢性髓系白血病PDLIM4基因表达与其启动子甲基化水平的关系

目的:分析慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者PDLIM4(PDZ and LIM domain 4)基因转录本表达状况、启动子高甲基化改变及临床相关性。方法:应用实时定量PCR(RQ-PCR)及实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)技术分别检测CML患者PDLIM4基因转录本及启动子甲基化水平。结果:8/36例(22%)CML患者存在PDLIM4低表达,低表达率与21例对照组间差异有统计学意义(P=0.021);PDLIM4表达水平和CML患者bcr/abl融合基因转录本正相关(r=0.434,P=0.043)。13/59例(22%)CML患者出现PDLIM4启动子高甲基化改变,而24例对照未显示高甲基化,两组差异有统计学意义(P=0.016)。PDLIM4高甲基化与患者血液学相关参数无明显相关性。PDLIM4启动子高甲基化频率随疾病进展而增高,在慢性期、加速期及急变期中分别为16%(7/44)、33%(2/6)及44%(4/9)。结论:PDLIM4基因启动子甲基化改变可能与CML的疾病发展有关。

慢性粒细胞白血病患者HAGE基因启动子的低甲基化

目的:探讨中国人群慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者螺旋酶抗原(helicase antigen,HAGE)基因启动子的甲基化状况和临床相关性。方法:应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对50例不同临床分期的CML患者骨髓标本HAGE基因启动子的甲基化状态进行检测。结果:13例(26%)CML患者存在HAGE基因启动子的低甲基化改变,而24例对照均无HAGE基因低甲基化,两组比较差异有统计学意义(P=0.007)。HAGE基因启动子低甲基化改变与CML患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、临床分期及染色体异常均无相关性(P>0.05)。慢性期、加速期和急变期患者中HAGE基因启动子低甲基化频率分别为25%(9/36)、25%(1/4)和30%(3/10)(P>0.05)。结论:HAGE基因启动子低甲基化是CML中的常见分子事件。

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化。方法:设计针对DAPK基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定。结果:所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测。