沉默Rho GDIα抑制矽肺上皮间质转化及其作用机制

目的探讨沉默Rho GDP解离抑制因子α(Rho GDP dissociation inhibitorα,Rho GDIα)对矽肺上皮间质转化的作用及机制。方法转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,分为空载体慢病毒组(LEV)、沉默Rho GDIα慢病毒感染组(Lv-Rho GDIα-inhibition)、TGF-β1诱导LEV组(LEV+TGF-β1)、TGF-β1诱导Lv-Rho GDIα-inhibition组(Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1)。采用Western blot法、免疫细胞化学染色检测Rho GDIα、RhoA、Rho激酶(Rho kinase,ROCK)、E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-I)蛋白表达,采用Western blot法及CCK-8检测细胞增殖能力。结果Western blot法及免疫细胞化学染色结果显示,与LEV对照组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达下降,E-cad蛋白表达上调,α-SMA和collagen-I蛋白表达下降;LEV+TGF-β1组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达上升,E-cad蛋白表达下调,α-SMA和collagen-I蛋白表达上升。与LEV+TGF-β1组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达下降,E-cad蛋白表达上调,α-SMA和collagen-I蛋白表达下降。CCK-8及cyclin D1蛋白检测结果显示,与LEV对照组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition组细胞增殖受到抑制,LEV+TGF-β1组细胞增殖增强,与LEV+TGF-β1组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1组细胞增殖受到抑制。结论沉默Rho GDIα可通过调控RhoA/ROCK信号通路抑制上皮间质转化发挥抗矽肺纤维化作用。

酸性哺乳动物几丁质酶早期诊断职业性尘肺病价值

目的观察酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)在矽肺模型大鼠肺组织和尘肺病患者支气管肺泡灌洗液(BALF)、血清中的表达,评价AMCase对尘肺病早期诊断的价值。方法 (1)将无特定病原体级成年雄性Wistar大鼠随机分对照组和模型组,每组15只;模型组大鼠采用动式吸入染尘法,予质量浓度为2 000.0 mg/m^(3)的游离二氧化硅粉尘每天染尘3 h,对照组大鼠不予染尘处理;2组大鼠分别于染尘第4、12和24周各处死5只。(2)采用随机数表法,选择191例进行大容量肺灌洗的职业性尘肺病患者为尘肺病组,选择12例进行大容量肺灌洗的粉尘作业人员为粉尘对照组,选择200名有粉尘作业史的健康煤矿工人为健康对照组。(3)采用蛋白免疫印迹法检测大鼠肺组织中AMCase、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对表达水平和人BALF中AMCase相对表达水平;采用酶联免疫法检测人血清AMCase水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清AMCase蛋白水平对于尘肺病的早期诊断价值。结果模型组大鼠肺组织AMCase、COLⅠ和α-SMA蛋白相对表达水均高于对照组(P值均<0.01)。尘肺病组和尘肺病壹期、贰期、叁期亚组人群BALF中AMCase蛋白相对表达水平均高于粉尘对照组(P值均<0.05),血清AMCase蛋白水平均高于健康对照组(P值均<0.05)。ROC曲线分析结果显示:采用血清AMCase蛋白水平预测尘肺病的ROC曲线下面积为0.78(95%可信区间为0.74~0.82);当血清AMCase蛋白水平截断值为466.0 ng/L时,灵敏性为73.8%,特异性为72.6%。结论血清AMCase蛋白对于尘肺病早期诊断具有一定价值,可能是潜在的尘肺病早期诊断生物标志物。

TGF-β1诱导肌成纤维细胞转化相关调节蛋白的蛋白组学筛选与验证

目的探讨双向凝胶电泳技术筛选及鉴定转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的差异蛋白质。方法将大鼠原代肺成纤维细胞分为对照组及5 ng/ml TGF-β1诱导组(1、24h),以双向凝胶电泳筛选差异蛋白,分离并进行质谱鉴定。以Western blot法、免疫荧光染色、免疫组织染色对5 ng/ml TGF-β1诱导(6~48 h)肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中差异蛋白[Rho GDP解离抑制因子α(Rho GDIα)]进行验证并对矽肺纤维化相关指标[α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型前胶原(pro collagen-I)蛋白]进行检测。通过建立矽肺大鼠模型对肺组织中差异蛋白进行验证并对矽肺纤维化相关指标进行检测。结果经蛋白组学技术筛选出TGF-β1诱导的大鼠原代肺成纤维细胞的9个差异蛋白,与对照组相比,TGF-β1诱导组有8个蛋白点表达上调,1个蛋白点表达下调,其中Rho GDIα表达上调(P<0.05)。Western blot及免疫组化结果显示,与对照组相比,肺成纤维细胞Rho GDIα、α-SMA和pro collagen-I蛋白水平随TGF-β1诱导时间延长而增加(P<0.05),免疫荧光染色显示Rho GDIα和α-SMA蛋白共表达。动式染尘大鼠肺组织Rho GDIα蛋白表达随染尘时间延长而增加(P<0.05)。结论双向凝胶电泳技术对TGF-β1诱导后大鼠原代肺成纤维细胞表达的差异蛋白进行了筛选,Rho GDIα可能与肌成纤维细胞转化密切相关。

应用iTRAQ技术对动式染尘矽肺大鼠肺组织差异蛋白的定量分析

目的筛选动式染尘矽肺大鼠肺组织差异蛋白并在动物体内及体外中验证,以期为矽肺早期诊断及相关机制研究提供新思路。方法构建动式染尘矽肺大鼠动物模型,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术联合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-trandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术筛选肺组织中的差异蛋白。免疫印迹试验检测差异蛋白在动物模型肺组织和SiO2诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达。结果共得到471个差异蛋白,其中252个上调蛋白,219个下调蛋白。差异倍数>1.5,共有28种差异表达蛋白,其中上调差异蛋白20种。在动物模型肺组织及SiO2诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中Factor B、PTPN2、VRK1和MOT4蛋白表达上调,差异均具有统计学意义(均有P<0.05)。结论差异蛋白Factor B、PTPN2、VRK1和MOT4蛋白可能是矽肺纤维化进程中的关键蛋白,为矽肺纤维化的研究提供了新靶点。