基于慕课的生物化学翻转课堂研究与实践

“慕课+翻转课堂”是实现线上与线下教育结合的全新混合式教学模式。该研究以四川农业大学生物化学MOOC为基础,充分利用网络和视频的线上资源,通过慕课堂和QQ学习群进行教学管理,在生物化学线下教学中开展基于MOOC的翻转课堂实践,该教学模式能更好地发挥学生的自主学习能力,且对培养学生的综合能力和促进教师教学能力提高有积极的促进作用。

“双一流”建设背景下生物化学混合式教学改革的研究与实践

生物化学课程是农业院校重要的专业基础课,文章在分析生物化学课程现状的基础上,提出构建以“学”为中心的“三环节+双主体+双提高”教学模式,通过抓好课前、课中和课后“三环节”,激活教师与学生“双主体”的互动共振,实现教师教学能力和学生学习能力的“双提高”,探索线上与线下结合的混合式教学改革实践,推动传统课堂教学模式改革创新。

家蚕幼虫5龄期中肠蛋白质组学

利用双向电泳技术对家蚕幼虫5龄期第2天、第5天和第7天的中肠蛋白质进行分离,并利用ImageMaster 2D Platinum对所分离得到的蛋白图谱进行比较,并对一些蛋白质斑点进行了质谱鉴定。研究发现,家蚕中肠蛋白质具有区别于家蚕其他组织的明显特征:蛋白质大多分布在PI值4-8、分子量20～70 kD的区域,且分布不均匀,主要集中在酸性一侧,这一特点在家蚕5龄期第7天的图谱尤为明显。5龄期家蚕第2天的蛋白质斑点数目为869个,而到第5天增加到966个,新增蛋白数目97个,进一步观察发现增加的蛋白主要分布在PI值6-9,分子量20～40kD区间;随着进入幼虫成熟期,蛋白质斑点数目明显减少,第7天斑点数仅为420个,比第5天减少了56.5%。这些结果说明家蚕中肠组织蛋白质组成在5龄早、中、晚期经历了较大变化,暗示这可能与中肠的功能相适应。从MALDI-TOF-MS鉴定的斑点发现了构成家蚕中肠组织的一些新的部分结构蛋白和一些可能与消化、吸收相关的蛋白,还发现一些能够抵御外界微生物入侵的相关蛋白。这些结果为进一步认识家蚕中肠提供了重要的理论基础。

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。

昆虫类免疫球蛋白结构和功能研究进展

类免疫球蛋白是在无脊椎动物体内发现的唯一的免疫球蛋白家族成员,它对鳞翅目昆虫自身的免疫起着重要的作用。已有研究表明:类免疫球蛋白只存在于鳞翅目昆虫体内,有可溶性和不溶性两种存在方式,在昆虫体内分别具有不同的功能。可溶性类免疫球蛋白通过一些酶和蛋白的作用对入侵昆虫的细菌和病毒进行免疫防御,而不溶性类免疫球蛋白(即以膜结合蛋白的形式出现)对细胞和细胞黏着以及病毒和细菌入侵细胞有着延缓作用。

家蚕Polh^+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。

利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。

苦荞锌指蛋白基因FtLSD1的克隆及其对非生物胁迫的应答

根据苦荞(Fagopyrum tataricum)花期转录组数据,分别以苦荞DNA和cDNA为模板,克隆得到1个苦荞C2C2型锌指蛋白基因FtLSD1(GenBank登录号KP252134)的DNA序列和cDNA序列,采用实时荧光定量PCR方法,研究了FtLSD1基因在非生物胁迫下的表达模式。结果显示:苦荞FtLSD1基因DNA全长2 427bp,由6个外显子和5个内含子构成,符合GU-AG剪切原则;cDNA序列包含一个528bp开放阅读框,编码175个氨基酸,具有LSD1家族的典型结构域;UV-B照射和水杨酸处理均能使FtLSD1基因的表达量上升,且UV-B处理在6h达到最大,为0h(CK)的3.84倍;水杨酸处理于10h达到最大,为0h(CK)的3.44倍,而4℃冷胁迫下该基因表达量保持稳定。推测该基因可能参与苦荞抗UV-B和高浓度水杨酸等非生物胁迫的应答反应,为苦荞的抗逆性研究提供新的视角。

家蚕类免疫球蛋白(hemolin)基因的克隆及表达特征和抗菌活性研究

Hemolin是昆虫的一种重要先天性免疫蛋白,属于免疫球蛋白超家族。克隆了家蚕hemolin基因,其序列全长5 100bp,含有5个外显子和4个内含子,基因cDNA编码含410个氨基酸的蛋白质,预测蛋白的分子质量约44.79 kD,pI 5.12。对该基因表达规律和生物学活性的结果研究表明:该基因只在家蚕蛹期脂肪体内特异性转录和表达,并能够被细菌和病毒诱导在幼虫期表达;该基因体外表达获得的重组蛋白具有抗菌生物学活性,能够有效抑制苏云金芽孢杆菌等的生长,由此暗示家蚕Hemolin蛋白可能在蚕体抵御病毒与细菌的感染过程中发挥重要作用。

黄瓜CDPK基因家族的鉴定与进化特征分析

【目的】对黄瓜基因组中CDPK基因的鉴定和进化特征的分析,为深入探索黄瓜CDPK蛋白生物学功能提供理论依据。【方法】用生物信息学方法,在黄瓜的全基因组范围内鉴定CDPK基因,并分析该基因的结构、染色体分布、进化关系及功能域。【结果】在黄瓜全基因组库中总共鉴定出17个CsCPKs,被分为4类;所有CsCPKs均含有6-8个内含子且都具有motif1~10,motif12和motif14;所编码氨基酸序列中含有4个EF-手型结构;多数CsCPKs具有棕榈酰化位点。【结论】CsCPKs都具有ATP结合、Ca2+结合和蛋白激酶活性的分子功能,参与蛋白质磷酸化的生物过程,而特有的motif决定了某些CsCPKs特有的生物学功能。

苦荞黄酮转运相关蛋白基因FtAH4L的克隆及表达分析

为研究苦荞黄酮转运相关基因,以苦荞(Fagopyrum tataricum)品种"西荞二号"为材料,克隆到1条质膜H+-ATPase基因(autoinhibited H+-ATPase isoform 4 like,AH4L),将其命名为FtAH4L。通过开放阅读框(ORF)分析,FtAH4L基因cDNA全长3 398bp,开放阅读框2 898bp,编码966个氨基酸残基,理论分子量为109kD,等电点6.48。氨基酸保守基序比对分析表明,AH4L在植物种间较为保守。在茉莉素诱导处理和5种光(白色荧光、LED白光、LED蓝光、LED红光和UV-B)处理芽期苦荞后,采用半定量RT-PCR和AlCl3比色法分析结果表明,茉莉素处理后的苦荞胚轴和子叶中FtAH4L基因表达量与黄酮含量均显著上升,且二者呈正相关关系;5种光对子叶中FtAH4L表达量无显著影响,但均显著增加其黄酮含量;胚轴中,除LED红光外,各种光均显著提高FtAH4L表达量和总黄酮含量,且LED蓝光与UV-B的影响极显著。该研究结果为深入研究FtAH4L基因参与苦荞黄酮转运奠定了基础。

基于线粒体DNA序列分析金虎尾目在蔷薇亚纲中的地位

【目的】探讨金虎尾目在蔷薇亚纲中的植物学地位。【方法】以金虎尾目,豆类以及锦葵类植物12条线粒体基因作为研究对象,利用最大似然法、最大简约法、近邻法分别构建系统发生树,对金虎尾目的植物学地位进行分析。【结果】最大似然法结果表明12条线粒体基因中,有9条线粒体基因支持金虎尾目属于锦葵类,支持率为29%~79%;有3条线粒体基因支持金虎尾目属于豆类,支持率为17%~52%。最大简约法结果表明12条线粒体基因中,有8条线粒体基因支持金虎尾目属于锦葵类,支持率为36%~85%;而支持金虎尾目属于豆类的仅有2条基因,支持率为25%和66%;其余的2条基因支持金虎尾目既不属于锦葵类也不属于豆类,支持率为77%和99%。近邻法结果表明12条线粒体基因中,有8条线粒体基因支持金虎尾目属于锦葵类,支持率为14%~82%;而只有3条基因表明金虎尾目属于豆类,支持率为36%~66%;其余的1条基因表明金虎尾目属于豆类和锦葵类分支之外,支持率为44%。【结论】上述3种模型分析结果表明,大多数基因的分类支持金虎尾目归属于锦葵类分支,同时具有高支持率。这个结果可为金虎尾目不完全谱系分选提供一定的证据。

中国野蚕一种强抗病毒蛋白的基因分析和活性鉴定

以最近报道的家蚕抗病毒蛋白基因为线索,从中国野蚕(Bombyx mandarina Moore)中肠内克隆了抗家蚕BmNPV病毒的SP-2cDNA(GenBank登录号:AY945210),基因大小855bp,编码284个氨基酸的蛋白质,分子量29.6kD,基因组全长1376bp,包含5个外显子和4个内含子.该基因的表达仅限于中肠,具有组织特异性,在幼虫龄中表达水平较高,而在眠期和熟蚕没有表达.推导其氨基酸序列,发现其C端氨基酸序列与已报道的家蚕相应序列差别较大,有8个氨基酸完全不同.通过体外重组技术,由高效基因表达系统获得大量重组蛋白,发现该蛋白具有很强的抗家蚕BmNPV活性,与家蚕对应的抗病毒蛋白BmSP-2相比,其抗BmNPV活性高1.6倍.初步认为,该蛋白质C端序列差异可能是造成家蚕与野蚕抗病毒活性差别的主要原因.

苦荞叶绿体基因组密码子偏爱性分析

本研究应用Codonw、CHIP、CUSP和SPSS软件对苦荞叶绿体基因组中38条蛋白质编码基因序列进行了偏爱性分析以及多元统计分析,获得了每个基因密码子3个位置的GC含量和ENC值以及所有基因序列的RSCU值,并与大肠杆菌、酵母、拟南芥以及水稻进行了对比分析。结果显示,苦荞叶绿体基因组基因密码子GC3含量明显低于GC2、GC1含量,表现出密码子对AT碱基结尾的偏爱性。中性绘图分析和ENC绘图分析表明苦荞叶绿体基因组的密码子偏爱性主要受选择的影响;通过和4种生物的密码子使用频率比较,发现其与大肠杆菌、水稻的密码子使用模式偏差较大,但与拟南芥、酵母的密码子使用模式相差较小,在此基础上确定了17种最优密码子。本研究分析结果对指导苦荞叶绿体基因进行分子改造,遗传转化,提高外源基因在苦荞的表达效率、新基因预测的准确性等基因工程问题具有一定的意义。

甜荞叶绿体基因密码子偏爱性分析

本研究利用软件Codon W、CUSP和SPSS对甜荞43条叶绿体基因序列进行密码子偏爱性分析和对应性分析,获得CG、ENC、RSCU等参数,并把甜荞和马铃薯、陆地棉、水稻、小麦等植物进行聚类分析。碱基组成结果显示,CG3明显低于CG_1和CG_2,说明甜荞叶绿体基因密码子偏爱A或T结尾。中性绘图分析、ENC与CG_(3s)相关性分析以及对应性分析表明,密码子偏爱性主要受选择作用的影响,但存在部分功能基因(如光合系统基因)主要受突变作用调控。基于RSCU的聚类分析表明,甜荞既不属于单子叶植物,又异于其他双子叶植物,其叶绿体基因密码子用法比较特殊。以上述为基础,我们确定了甜荞叶绿体的14个最优密码子。该研究成果可为进一步确定甜荞在植物分类学中的位置奠定基础,从而对现有的系统发育树进行重要补充。此外,该结果对甜荞叶绿体中某些未知功能基因的预测、发现新基因、提高以甜荞为目的宿主的外源基因的表达量都具有重要意义。

苦荞过敏蛋白TBW17基因克隆及其抗原表位分析

基于苦荞转录组数据，采用RT-PCR技术克隆到1条苦荞过敏原蛋白基因的cDNA序列TBW17，并采用生物信息学方法对其编码蛋白进行了结构分析和抗原表位分析。结果表明，TBW17含有1个480bp的开放阅读框，编码159个氨基酸，其氨基酸序列与多种植物过敏原蛋白同源性达52．20％～97．48％，蛋白家族分类显示其归为过敏蛋白中常见的Bet v1家族。抗原表位预测分析表明，该编码蛋白的T细胞表位位于91～99位，而B细胞表位位于第9～17、45～53和59～66位。以上结果为进一步对苦荞过敏原蛋白的检测和致敏机制研究提供了一定的理论基础。

苦荞锌指蛋白基因FtLOL1的克隆及其对非生物胁迫的应答

根据苦荞(Fagopyrum tataricum)花期转录组数据,采用RT-PCR技术和PCR技术克隆得到一个C2C2型锌指蛋白基因Ft LOL1(Ft LSD-one-like 1,Gen Bank登录号:KP260662),获得c DNA和DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术研究Ft LOL1在3种非生物处理条件下的表达模式。结果显示,苦荞Ft LOL1基因DNA全长1 720bp,由5个外显子和4个内含子组成,符合GT-AG剪切原则;c DNA包含一个444 bp的开放阅读框,编码147个氨基酸,具有LSD1家族的典型特征;2mmol/L水杨酸、UV-B照射和4℃冷处理均能导致Ft LOL1基因表达量下降,其中水杨酸和UV-B处理均在12h达到最小值,分别为对照组(0h)的11.9%和33.8%,而4℃冷处理条件下,Ft LOL1表达量12h开始下降,至24h达到最小值,为对照组(0h)的50.7%,36h后表达量有所回升,稳定在对照组(0h)的60%左右。推测该基因可能参与苦荞抗高浓度水杨酸、UV-B照射和冷胁迫等非生物胁迫的应答反应,为探究苦荞抗逆性提供了新的视角。

寨卡病毒基因组密码子偏爱性分析

寨卡病毒是一类对人类危害极重的RNA病毒,为了解其密码子使用特点和主要影响因素,本研究采用CHIPS、CUSP、Codon W和SPSS软件对寨卡病毒所有基因序列进行了偏爱性分析和多元统计分析,获得了每个基因密码子3个位置的GC含量和ENC值以及所有基因序列的RSCU值,并与大肠杆菌、酵母、人的密码子使用频率进行了对比分析。结果显示,寨卡病毒GC3含量相对较高,为54.14%,ENC值为52.54,表明该病毒密码子偏爱性偏低且偏爱以G、C、A碱基结尾的密码子,这和一般病毒的偏爱性有所不同。中性绘图和ENC绘图分析表明密码子的偏爱性主要受到选择作用的影响。通过和其它3种生物密码子使用频率进行比较,发现其与人的密码子使用频率相差最小。在此基础上确定了寨卡的18个最优密码子。研究结果对寨卡病毒寻找最佳宿主进行体外表达,从而研发基因工程疫苗及治疗性抗体具有一定的意义。

中东呼吸综合征冠状病毒结构蛋白与附属蛋白编码基因密码子偏爱性分析

中东呼吸综合征冠状病毒是一类对人类危害极重的RNA病毒,为了解其密码子使用特点和主要影响因素,该文采用CHIPS、CUSP、CodonW和SPSS软件对MERS-CoV 9条基因序列进行了偏爱性分析和多元统计分析,获得了每个基因密码子3个位置的GC含量和ENC值以及所有基因序列的RSCU值,并与大肠杆菌、酵母、人的密码子使用频率进行了对比分析。结果显示GC3明显低于GC2、GC1且小于50%,ENC值为50.59,表明该病毒密码子偏爱性偏低且偏爱以A、T碱基结尾的密码子。中性绘图和ENC绘图分析表明密码子的偏爱性主要受到选择作用的影响。通过和其它三种生物密码子使用频率进行比较,发现其与酵母密码子使用频率相差最小。在此基础上确定了MERS-CoV的19个最优密码子。研究结果对MERS-CoV寻找最佳宿主进行体外表达,从而研发基因工程疫苗及治疗性抗体具有一定的意义。

蓼科大黄属植物CHS基因密码子偏爱性分析

为探究蓼科大黄属物种CHS基因密码子的偏爱性,鉴定出该类基因的最优密码子。利用EMBOSS、Codon W1.4.4和SPSS 17.0软件对24条来源于大黄属不同物种的CHS基因进行多元统计分析,以深入研究其偏爱性。结果表明,大黄属CHS基因密码子的GC_3含量最高,其与GC_(12)的相关性检验未达到显著水平。ENC-plot分析显示,24条CHS基因的ENC值均低于预期值。以上证明了自然选择是CHS基因密码子偏爱性形成的主导因素。筛选出的26个最优密码子中,17个密码子的第3位碱基为G/C,表明CHS基因最优密码子偏爱以G/C结尾。