大豆根部两株产植酸酶菌的分离鉴定及中性植酸酶基因的克隆

从大豆根部土壤中筛选到两株产植酸酶的细菌菌株,对其进行形态学分析和16S rRNA鉴定,确定两个菌株为枯草芽孢杆菌,并对其植酸酶的酶学性质进行初步研究。通过PCR方法从该芽孢杆菌基因组中克隆了植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE)。与NCBI已报道的植酸酶序列分别通过BLASTn和BLASTp程序进行比对,确定phy(ycD)和phy(ycE)属于β-螺旋桨植酸酶家族。两个植酸酶核酸序列同源性达到98%。两个基因的开放阅读框(ORF)均为1149个核苷酸,编码382个氨基酸。N端26个氨基酸为信号肽序列,整个酶分子有5个氨基酸不同,运用SWI SS-MODEL服务器进行同源建模,使用Spdbv软件对其三维结构评估,这5个氨基酸中的4个分别处在酶分子不同二级结构部位。β-螺旋桨植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE)的获得,为进一步探讨中性植酸酶的结构与功能以及该类植酸酶的产业化应用提供实验数据。

β-螺旋桨植酸酶的金属离子依赖性

β-螺旋桨植酸酶主要来源于芽孢杆菌,是能够分解植酸释放磷元素,并且与金属离子有关的一类酶。β-螺旋桨植酸酶具有独有的Ca2+依赖性和对植酸-Ca2+复合物的底物专一性。本文综述以Ca2+为主的金属离子与β-螺旋桨植酸酶的关系。

两株芽孢杆菌的鉴定及淀粉酶基因的克隆

对分离得到的两个菌株(B.H和B.M)进行鉴定,并对它们在芽孢杆菌培养基和淀粉富集培养基上的形态进行观察,通过对其16S rDNA序列的分析,构建系统进化树,确定B.H为枯草芽孢杆菌,B.M为解淀粉芽孢杆菌。根据已报道的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶基因保守区域设计引物,分别以两个菌株的基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法成功获得两个淀粉酶基因,其编码区的长度分别为1 434 bp和1 563 bp,为该菌株的进一步利用开发提供了数据支持。

多位点突变提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性

为提高大肠杆菌植酸酶AppA(一种已得到广泛应用的饲料添加剂,其酶活高,pH作用范围广,但热稳定性较差)热稳定性,在appA基因上组合突变了W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10个位点,突变后的基因命名为appAM10。将野生型appAppA和突变体appAM10ppAM10基因转入毕赤酵母GS115进行表达,并对重组蛋白AppA和AppAM10进行了酶学性质研究与比较。结果表明:AppAM10分子量约为55kDa,比活性为3022U/mg,AppAM10的K_m=330μmo1/L,V_(max)=3147U/mg。AppAM10的最适pH值为4.5,最适反应温度为65℃。与野生型的AppA的最适pH无明显区别,比AppA的最适温度提高了5℃。经90℃孵育15min后,AppA完全失活,而AppAM10仍残留17.5%的活性,T_m值提高约8℃,说明上述10个位点的组合突变有利于提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性,其中与N-糖基化有关的N204C、Q258N和Q349N3个位点可能起着重要作用。

河南省绿色农业发展存在问题及对策

绿色发展是现代农业发展的内在要求,是生态文明建设的核心要义。河南省是我国的粮食大省,但其在绿色农业发展方面面临绿色农业科技发展落后、生态保护意识薄弱、有效的激励补偿措施缺乏、绿色农业发展环境较差等方面,需要采取促进农药化肥减量增效、促进畜禽粪污资源化利用、加强绿色发展新技术的使用、加大财政支农力度等措施,大力推进河南省绿色农业发展。

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.

芽孢杆菌植酸酶phy(ycD)基因在大肠杆菌中的异源表达与纯化

为研究中性植酸酶的性质,将芽孢杆菌来源植酸酶基因phy(ycD)构建到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,进行诱导表达,利用Ni-NAT和Superdex-75纯化后,对重组植酸酶r-phy(ycD)的性质进行分析.结果显示,该酶是Ca2+依赖性酶,Ca2+最适浓度为1 mmol/L,酶比活为4.7 U/mg,酶促反应的最适pH为6.5,在中性条件下稳定,最适反应温度为45℃,K m值和V max值分别为0.213 mmol/L和5.55 U/mg.Zn2+、Ni2+、Ba2+和Ag2+对酶促反应均有显著抑制作用.本研究表明,Ca2+对该类酶的活性和热稳定性起着关键性作用,因此在表达和纯化过程中需要在培养基和纯化所需的各类缓冲液中添加Ca2+.