猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。

2012年～2015年安徽地区猪丹毒的流行特征及病原分离株药物敏感性分析

为了解猪丹毒在安徽地区的流行特征和再发原因以及临床防治的敏感药物,本研究针对2012年~2015年安徽地区发生的猪丹毒进行流行病学调查,对分离菌株进行吖啶黄敏感性试验以及微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,在合肥、六安、安庆、蚌埠等地猪丹毒发生率较高,7月~9月为高峰期,主要集中于育肥阶段(61.9%),以急性败血症型为主(92.9%)。42株分离菌株虽对青霉素(PEN)、氨苄青霉素(AMP)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)等抗生素的敏感率均高于80%,但耐受5种及以上抗菌药物的比例达95.2%,其中耐庆大霉素(GEN)+卡那霉素(KAN)+链霉素(STR)+克林霉素(CLI)+林肯霉素(LIN)占81%。有4株可以在含0.02%吖啶黄的脑心浸液培养基(BHI)琼脂平板上生长。结果表明,安徽地区猪丹毒呈散发性或地方性流行,多发生于夏秋季节,临床特征多为育肥猪的急性败血症,青霉素类药物仍是防治猪丹毒的首选药物。本研究揭示安徽地区猪丹毒再发原因与弱毒菌苗株可能的毒力返强无关,并为该地区猪丹毒的有效防控提供科学依据。

猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立和评价

为建立猪丹毒丝菌的快速检测方法,本研究根据猪丹毒丝菌荚膜多糖的保守区域设计特异性引物,通过优化反应体系建立了检测猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR方法。并对人工感染小鼠和临床病例样品进行检测。结果显示,质粒标准品在5.52×10~8拷贝/μL～5.52×10~2拷贝/μL范围内呈良好的线性关系;该方法与其它6种猪常见细菌均无交叉反应;最低可检测到20拷贝/μL的阳性质粒标准品,比普通PCR方法敏感性高100倍;批内和批间变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以用于猪丹毒的早期诊断和生产实际中大批量临床样品的猪丹毒丝菌检测。

副猪嗜血杆菌TbpA对仔猪的免疫效力评价

本研究旨在了解副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A(TbpA)对仔猪的免疫保护性,从而为HPS新型疫苗的研发奠定基础。采用HPS血清型13型灭活全菌体以及浓度分别为0.5、0.25mg·4mL^(-1)的重组TbpA,经3次间隔期均为14d的免疫后,检测仔猪抗体(IgG)水平及细胞因子(IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α)水平;以相同血清型菌株7LD50剂量,腹腔攻毒,检查病理学变化及其免疫保护率。结果显示:HPS的重组TbpA能诱导仔猪产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。重组TbpA和灭活全菌体在免疫后均能使仔猪获得免疫保护,其中0.5mg·4mL^(-1) TbpA和灭活全菌体的免疫保护率均为100%,组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异明显。HPS的TbpA能激发仔猪的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为一种新的疫苗候选抗原。

猪丹毒丝菌灭活疫苗制备及其对小鼠免疫效力的评价

为制备猪丹毒丝菌灭活疫苗并评价其对小鼠的免疫效力,将3株受试菌株(AEr21、AEr31和AEr32)培养至稳定期,经终质量浓度为2mg/L甲醛灭活后,用矿物油佐剂ISA201VG制备成猪丹毒丝菌灭活疫苗,并与商品化疫苗分别免疫小鼠。应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ),流式细胞术测定CD4^+/CD3^+、CD8+/CD3^+T细胞亚群百分比,采用灌胃和腹腔注射方式测定免疫保护率,并采集小鼠脏器(肺脏、肝脏、脾脏、肾脏)制备病理组织切片,观察病理变化。结果显示,AEr21、AEr31、AEr32全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒疫苗组、灭活疫苗组二次免疫小鼠后的血清IgG抗体效价分别为1∶3200、1∶6400、1∶1600、1∶6400、1∶3200(以全菌体超声裂解物为包被抗原)和1∶3200、1∶6400、1∶3200、1∶25600、1∶6400(以重组SpaA为包被抗原);商品化弱毒疫苗组诱导小鼠产生的细胞因子水平和CD4^+/CD3^+、CD8+/CD3^+T细胞比例最高,与灭活疫苗组差异显著,各灭活疫苗组间差异均不显著;AEr21、AEr31、AEr32全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒疫苗组、灭活疫苗组对灌胃和腹腔注射攻毒小鼠的免疫保护率分别为80%、100%、100%、100%、100%和80%、100%、60%、100%、100%;AEr21和AEr32全菌体灭活疫苗组的病理组织变化较AEr31全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒疫苗组、灭活疫苗组更显著。表明受试菌株(AEr31)与矿物油佐剂ISA201VG制备成的猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较高水平的细胞免疫和体液免疫,还可完全抵抗强毒株的攻击。

猪红斑丹毒丝菌制苗用菌株的筛选

为筛选出致病力强、抗原性优良、遗传性状相对纯一稳定的猪红斑丹毒丝菌制苗用菌株,对42株临床分离的猪红斑丹毒丝菌进行筛选,通过小鼠致死性试验确定4株受试菌株,编号为AEr9、AEr21、AEr31和AEr32。采用改良寇氏法测定受试菌株的半数致死量(LD50),通过微量平板凝集和琼脂扩散试验测定反应原性,基于小鼠免疫攻毒试验测定免疫原性,并通过连续传代培养,分别对第10、20、30代受试菌株进行LD50、沉淀抗体滴度和免疫保护率检测,以确定稳定性。结果显示,AEr9、AEr21、AEr31、AEr32的LD50分别为845、50.3、35.5和10.1 cfu·m L-1,微量平板凝集试验和琼脂扩散试验进一步筛选出反应原性高的菌株AEr21和AEr31。灭活全菌体免疫小鼠,均产生免疫保护力,以AEr31免疫保护力最好。细菌传10代后,两株菌毒力均出现致病力减弱的情况,第10、20、30代菌株致病力趋向于稳定,AEr21引起的兔抗猪丹毒血清沉淀抗体滴度水平更稳定。说明菌株AEr21、AEr31具备毒力强、抗原性好、遗传稳定的特性,可作为猪红斑丹毒丝菌制灭活苗用的候选菌株。

猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂的筛选

为筛选猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂,将5种佐剂(聚合物佐剂、矿物油佐剂ISA 201 VG、蜂胶佐剂、弗氏佐剂、铝胶佐剂)分别与3株猪丹毒丝菌株(AEr21、AEr31和AEr32)制备成15种灭活疫苗,经物理性状检验、无菌检验、安全检验合格后分别免疫小鼠,应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)。通过腹腔注射和灌胃2种方式对免疫后小鼠进行攻毒,计算免疫保护率。结果显示,5种佐剂与3株猪丹毒丝菌株制备的灭活疫苗均可刺激小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫,矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组诱导小鼠产生的IgG抗体水平和细胞因子含量最高,与铝胶佐剂、弗氏佐剂疫苗免疫组差异显著(P<0.05),与聚合物佐剂、蜂胶佐剂疫苗免疫组差异不显著(P>0.05);矿物油佐剂ISA 201 VG疫苗免疫组在攻毒后的免疫保护率最高,对腹腔注射和灌胃攻毒小鼠的免疫保护率分别为80%、80%、60%和100%、100%、80%。试验结果表明,矿物油佐剂ISA 201 VG可作为猪丹毒丝菌灭活疫苗制备的候选免疫佐剂。

锥形滚动筛技术改造实践

介绍了雅矿石灰石破碎筛选系统改进的实践。

安徽省某牛场常见疾病调查分析

为了解并有效防控某牛场常见疾病,笔者对某牛场3、4月份常见疾病进行了现场调查,将获得的数据进行整理、分析、归纳、总结,结果发现该牛场常见疾病呈散发性,包括呼吸系统疾病108例(其中咳嗽67头、气喘41头)、犊牛腹泻69例、腐蹄病79例、胎衣不下33例等。其原因为消毒不彻底、饲料配比和用药不合理。此外,这几种常见病的发病情况与环境变化也有很大的关系。

康明斯NT系列强化柴油机曲轴断裂原因分析

分析了康明斯NTA85 5 -C4 0 0发动机曲轴断裂故障的原因 ,并提出了预防措施以及在修理过程中应该注意的一些问题。

腹泻仔猪源致病性大肠杆菌生物膜与耐药性及毒力的相关性

【目的】探讨腹泻仔猪源致病性大肠杆菌生物膜形成能力及其与耐药性、毒力之间的相关性。【方法】收集临床分离鉴定的129株致病性大肠杆菌,采用96孔微量板法、K-B法、微量稀释法、寇氏改良法分别测定体外生物膜形成能力、耐药表型、生物膜菌与浮游菌的最小抑菌浓度(MIC)、对小鼠的半数致死量(LD_(50))。【结果】129株致病性大肠杆菌生物膜阳性率为96.1%,以弱阳性(1+)为主;分离株对四环素、氨苄青霉素、阿莫西林的耐药率分别为92.2%、92.2%、93%,对亚胺培南的耐药率最低为1.6%,共呈现94种多重耐药谱,其中以阿莫西林-氨苄青霉素-四环素-强力霉素-复方新诺明-甲氧苄啶构成比最大,为86.0%,且其与环丙沙星、氟苯尼考、左氧氟沙星、诺氧沙星、头孢拉定及头孢哌酮的耐药性有相关性(P<0.05),环丙沙星和氟苯尼考对生物膜形成菌的MIC较对应浮游菌分别提高2-16倍和8-16倍;生物膜形成能力3+的菌株LD_(50)最大。【结论】腹泻仔猪源致病性大肠杆菌普遍具有生物膜形成能力,呈现多重耐药,生物膜形成菌对环丙沙星及氟苯尼考的耐药性与生物膜形成能力呈正相关,但随着生物膜形成能力的增强,LD_(50)值则相应增大。

2012–2015年江淮地区猪丹毒杆菌分离株血清型、spaA基因遗传进化及PFGE基因型分析

【目的】了解2012–2015年江淮地区猪丹毒杆菌分离株血清型分布、spa A基因遗传进化关系和基因分型特征。【方法】收集临床分离鉴定的42株猪丹毒杆菌,应用琼脂扩散沉淀实验、PCR扩增和序列分析技术、脉冲场凝胶电泳分型技术(PFGE)分别测定分离株的血清型、spa A基因遗传变异性及PFGE基因型。【结果】42株猪丹毒杆菌分离株血清型均为1a型;spa A基因与猪丹毒杆菌国内外参考株核苷酸序列相似性为98.5%–100%,分离株在第609 bp处出现T突变为G、769 bp处C突变为A,对应的氨基酸第203位Ile突变为Met、第257位Leu突变为Ile,为Met-203、Ile-257型;分离株形成8个PFGE基因型,相似度达88.8%–100%,优势基因型为ER2(54.8%),弱毒疫苗G_4T_(10)和GC_(42)株独立为同一个基因型。【结论】江淮地区致病猪丹毒杆菌流行血清型为1a型,spa A基因相似性高,分离株变异小、源于同一克隆系,Met-203、Ile-257型菌株致病力强,是江淮地区猪丹毒发生与流行的主要致病菌型。

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。

锥形滚动筛技术改造实践

雅满苏石灰石矿破碎系统是1993年自行设计安装的单系列生产线。随着市场竞争的加剧和用户需求的多元化，原有的破碎筛选系统生产出来的产品已不适应当前市场的需要。我矿在2002年对石灰石破碎筛选系统进行了改造。经过1年多的生产情况来看，改造达到了理想的效果。

猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的致病性研究

为了了解猪丹毒丝菌安徽分离株（BB130818）对小鼠的致病性,试验采用改良寇氏法测定猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的半数致死量（LD50）,应用1×LD50和100×LD50菌量分别攻毒感染小鼠,通过实时荧光定量PCR技术检测感染菌株在小鼠体内的分布情况,并采集以100×LD50剂量攻毒时小鼠的脾脏、肺脏、肝脏制作组织切片观察病理变化。结果表明：猪丹毒丝菌安徽分离株对小鼠的LD50为50.3 cfu/m L;以1×LD50剂量攻毒36 h后即可从小鼠心脏、脾脏和脑组织中检出该菌,48 h后可从小鼠肝脏、肺脏中检出该菌;以100×LD50剂量攻毒24 h后即可从小鼠心脏、脾脏、肺脏和脑组织中检出该菌,36 h后可从小鼠肝脏中检出该菌;小鼠全身败血性出血,脾脏、肺脏、肝脏均出现病变。说明猪丹毒丝菌安徽分离株具有较强的致病力,进入小鼠体内的主要增殖器官首先是心脏、脾脏和脑组织,然后到肺脏和肝脏。