纯化水及注射用水系统设计若干问题的探讨

根据药品生产的水质特点及GMP法规等要求,对纯化水和注射用水系统设计方面的制水、储存与分配、用水点设置等问题进行了探讨。并附上具体的示意图举例说明。

吹灌封车间设计若干问题的探讨

根据吹灌封药品生产的工艺技术特点及GMP法规等要求,对吹灌封车间设计方面的无菌产品生产工艺选择、设备选型、环境洁净度设置、塑料颗粒选材等问题进行了探讨。并附上具体的示意图举例说明。

乙型肝炎病毒3’末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒 ａｄｒ亚型的基因组 ＤＮＡ中分离 ３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 ＤＮＡ片段，构建了由ＣＭＶ启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法，获得了基因组整合有３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的２个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ＥＬＩＳＡ分析，发现在这２个小鼠品系中３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因可被表达，而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立，对于探讨乙型肝炎病毒３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。

Mx-cre转基因小鼠品系的建立及其培育

将携带ＭＸ启动子调控的Ｃｒｅ基因真核表达载体ｐＭｘ－ｃｒｅ线性化后，通过受精卵显微注射途径制备转基因小鼠。共注射９９个卵，产仔２０只，利用ＰＣＲ对小鼠进行筛选，以基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ确证，最后得到一个阳性的小鼠品系，进而将其保种和扩大繁殖。

通过胚胎干细胞途径获得的嵌合体小鼠中neo基因在各组织中的分布

为探讨小鼠胚胎干细胞参与早期胚胎发育的潜能 ,以neo基因作为目的基因进行了胚胎干细胞的转染 ,经G41 8的筛选 ,获得表达neo基因的单克隆细胞 ,挑取部分克隆扩大 ,进行小鼠囊胚腔注射 ,再重新植入小鼠子宫 ,共注射了 60个囊胚 ,分别回输到 5只假孕小鼠 ,在子代中得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠。通过对嵌合体小鼠各组织PCR分析发现 ,neo基因可以在皮肤、肝脏。

渤海俗所贵者“太白山之菟”考辨

《新唐书·渤海传》记渤海"俗所贵者"总计十四项。其中的"太白山之菟",唐晏、黄维翰和金毓黻诸先生皆主张应改为"太白山之兔"。从上个世纪八十年代后期开始,这种传统的观点受到了不断的挑战,相继出现"东北虎"说和"茯苓"说两种观点,对于这些新观点的提出与发表,在进一步寻求根据的过程中,我们逐渐感到新说仍难持立,旧说尚难率而易之。

脂肪酸缩水甘油酯的制备及固化性能

环氧树脂黏度大脆性强,通常需要降黏增韧才能应用。文中以油酸和环氧氯丙烷为原料,通过两步法反应在中试50 L反应釜中制备了油酸缩水甘油酯(GO),并将其作为稀释增韧剂用于双酚A环氧树脂(DGEBA)的改性。采用傅里叶变换红外光谱仪、核磁共振氢谱、电位滴定仪和黏度仪对产物进行了结构表征和性能测试。力学性能分析表明,当GO与DGEBA质量比为10%时,GO/DGEBA固化物的力学性能最佳,拉伸强度和冲击强度比纯DGEBA分别提升了14.7%和71.4%。冲击断裂面的扫描电子显微镜结果表明,10%GO/DGEBA固化物表现出良好的韧性断裂特征。差示扫描量热法(DSC)结果表明,随着GO含量的增大,固化物的玻璃化转变温度(Tg)随之降低。采用非等温DSC法对DGEBA/DDM和10%GO/DGEBA/DDM固化体系进行动力学模拟,结果符合Šesták-Berggren模型。

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的:从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子(ROP)并建立ROP-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因转基因小鼠模型。方法:用PCR法从基因组内扩增ROP,通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体,并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pmROP-EGFP表达质粒经Nol I酶切线性化后,用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核,制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建者小鼠,基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传代后,取眼球进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察视网膜上GFP的表达。结果:从基因组内扩增出了2.1 kb的小鼠ROP,成功构建了小鼠ROP-GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建者,分别命名为C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU21、C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26、C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论:成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠,它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制,还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。

TRAIL在细胞中的表达及其诱导凋亡的活性分析

以ＰＣＲ方法克隆了Ｔｒａｉｌ ｃＤＮＡ全长，构建了其真核表达载体，通过脂质体转染ＨｅＬａ细胞，４８小时后利用流式细胞仪分析Ｔｒａｉｌ诱导细胞凋亡的比率，发现发生凋亡的细胞为总细胞数的１９％。证实Ｔｒａｉｌ真核表达系统的产物的生物学活性高，为从真核表达的途径获得Ｔｒａｉｌ基因工程产品奠定了基础。

糖皮质激素受体基因片段的克隆和目标载体的构建

目的：构建针对糖皮质激素受体（ＧＲ）基因第２ 外显子的目标载体，为获得糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法：通过限制性酶切对ＤＮＡ片段进行了结构分析，克隆相应ＤＮＡ片段进行ＤＮＡ 序列测定，利用ｐＴＫ－Ｎｅｏ 质粒框架和同源片段构建载体。结果：详细分析了ＧＲ基因第２ 外显子及其侧翼的基因组ＤＮＡ片段结构，克隆了同源片段，构建了目标载体。结论：这一载体的构建将为进一步建立ＧＲ基因剔除小鼠奠定基础。

GR基因片段的克隆和可诱导的目标载体的构建

为了构建针对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子的可诱导目标载体，我们对小鼠糖皮质激素受体基因第２外显子及其侧翼区域的基因组ＤＮＡ片段进行了结构分析，和部分片段的亚克隆，然后以ｐＦ１ｏｘ质粒为框架构建了可诱导的目标载体。这一载体的构建为进一步建立诱导型ＧＲ基因剔除小鼠奠定了基础，而且对于深入研究ＧＲ基因的表达调控也很有帮助。

可用于转基因动物的基因诱导表达系统

可诱导的基因表达系统对于研究基因的功能活动及其产物的生物学功能很有意义。它在转基因动物中的应用已经十分成功。本文介绍了最近出现的ＩＮＦ－ Ｍｘ１ 诱导表达系统、Ｔｅｔｏ 诱导表达系统、Ｅ－ ＥＣＲ 诱导表达系统和ＲＵ４８６ 诱导表达系统的基本原理及其应用情况，并对其优缺点进行了分析和评价。

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能。方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后,琼脂糖电泳回收目的片段,用原核显微注射法将其注射入雄原核,制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder;免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果:成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后,出生并存活了11只新生鼠,经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠,命名为C57-TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配,进行传代培育,复合PCR法筛选阳性转基因小鼠,目前已传至F4代。结论:本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57-TgN(HBx)SMMU,它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的:评价乙肝转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.O)SMMU生物学特征的稳定性。方法:以F5代乙肝转基因小鼠C57-TgN(HBV adr2.O)SMMU为研究对象,采用基因组DNA PCR、血清ELISA检测、Western印迹分析、免疫组织化学、血清DNA PCR、透射电镜和H-E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合、表达、复制和组织学变化。结果:F1代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因,肝组织中可检测到HBsAg、HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白,血清中HB-sAg和HBeAg的表达率分别为19.54％和3.39％,且在血清和肝组织中存在病毒DNA和病毒样颗粒;长期的病毒DNA整合、表达和复制可以引起转基因小鼠肝、肺等组织的病理性损伤。结论:乙肝转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.O:)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA、血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征,并具有一定的组织学变化,作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的 :建立乙型肝炎病毒核心抗原 (ayw亚型 )转基因小鼠模型。 方法 :采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠 ,以 PCR、免疫组化和 H- E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合、肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果 :得到 6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者 (founder)小鼠 ,其中 1只在肝细胞核和胞浆均有 HBc Ag的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代 ,F1 代 10只小鼠中的 4只小鼠肝细胞有 HBc Ag的表达。 结论 :建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠 ,核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达 。

干细胞样肝原始细胞的分离和鉴定

目的 :证实小鼠胎肝中肝干细胞的存在。方法 :小鼠胎肝细胞的分离培养和免疫细胞化学等。结果 :从小鼠胎肝组织中成功地分离得到了AFP、CD34及Albumin等特异性分子标记阳性、并呈集落样生长的细胞系。结论 :小鼠胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞 。

干扰素诱导Mx-Cre转基因小鼠表达的重组酶活性的体外检测

利用ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫组化、免疫金标电镜、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ从ＤＮＡ水平、蛋白水平分析干扰素诱导后Ｍｘ－Ｃｒｅ转基因小鼠肝组织中Ｃｒｅ重组酶的表达及其表达产物的活性。在对Ｍｘ－ｃｒｅ转基因小鼠基因组中整合有ｃｒｅ基因进行确定后，通过干扰素诱导Ｍｘ－ｃｒｅ转基因小鼠表达Ｃｒｅ重组酶，结果表明转基因小鼠肝细胞核和细胞质中均有Ｃｒｅ重组酶的表达，并在超微水平进一步证实。将含表达的Ｃｒｅ重组酶的肝细胞核抽提液加入到带有ｌｏｘＰ位点的ＤＮＡ中进行重组，分析证明Ｍｘ－Ｃｒｅ转基因小鼠表达的Ｃｒｅ重组酶具有重组活性，从而建立了体外检测Ｍｘ－Ｃｒｅ转基因小鼠表达的Ｃｒｅ重组酶活性的方法。

C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU转基因小鼠肝脏的组织病理学观察

目的:研究乙型肝炎转基因小鼠品系C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU肝脏的组织学及免疫病理学特征。方法:以168只SPF级乙肝转基因小鼠及15只正常C57BL/6小鼠为研究对象,取肝组织连续切片,常规H E染色,并选取20 例有明显单个核细胞肝内浸润的肝标本,免疫组化原位鉴定白细胞分化抗原的肝内分布。结果:37.5%的转基因小鼠肝脏出现人慢性轻度乙型肝炎样的病理改变,病变率随月龄增大显著增高;32.7%有更轻微的非特异性炎症反应;肝内浸润的单个核细胞多数为CD3+、CD4+细胞,未发现CD57+、CD8+细胞浸润。结论:乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU肝脏可出现不同程度的病理改变,与人慢性轻度乙肝组织学相类似。

HBV病毒蛋白在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU小鼠中的表达

目的:分析C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系转基因小鼠血清和组织中病毒蛋白的表达及其特征.方法:以138只F6～F17代C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系的转基因小鼠为研究对象,采用血清ELISA检测和免疫组织化学的方法分析病毒蛋白在转基因小鼠中的表达.结果:转基因小鼠血清中HBsAg和HBeAg的阳性率分别为55.18%和25.00%,血清中HBsAg的出现时间多在3个月龄之前(占93.33%),且持续时间在9个月以上(占95.56%),个体之间具有一定差异.转基因小鼠肝组织中至少可检测到一种病毒蛋白,HBsAg、HBcAg和X蛋白的检出率分别为85.82%、58.24%和49.61%.HBsAg分布于肝细胞质中,HBcAg和X蛋白既可分布于肝细胞核中,也可分布干肝细胞质中.HBsAg的表达具有细胞特异性(门管区周围的肝细胞)和组织特异性(肝和肾),X蛋白除在肝脏和肾脏中表达外,还可在脑组织中表达.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系转基因小鼠血清和肝肾等组织中有病毒蛋白的表达,病毒蛋白的分布具有组织细胞特异性和个体差异.