大黄鱼DIGIRR通过抑制MyD88-NF-κB的激活参与免疫调控

为研究大黄鱼双免疫球蛋白白细胞介素1受体相关分子(double immunoglobulin interleukin-1 receptor-related molecule,DIGIRR)在免疫反应中的作用,本实验克隆了大黄鱼digirr(Lcdigirr)的编码区序列;采用荧光定量PCR(qPCR)对大黄鱼各组织及免疫刺激后的脾脏、头肾等组织及大黄鱼肾细胞系(LCK)中的Lcdigirr表达情况进行了检测;构建了重组表达质粒pTurboGFP-DIGIRR及pcDNA3.1-DIGIRR,分别以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因及双荧光素酶报告系统,研究了LcDIGIRR的亚细胞定位及过表达后对NF-κB启动子活性的调控。结果显示,Lcdigirr的开放读码框(ORF)包含1575 bp核苷酸,编码524个氨基酸,理论分子量为59.4 ku、等电点(pI)为5.76,N端包含2个免疫球蛋白(Ig)结构域、1个跨膜区及1个Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域,属于保守的硬骨鱼类DIGIRR家族;qPCR结果显示,Lcdigirr在大黄鱼多组织均有表达,其中在肠道中表达量最高;采用变形假单胞菌及脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、多聚肌-胞苷酸[poly(I:C)]等分别进行体内与体外刺激,均可诱导其表达量显著增加;亚细胞定位结果显示,LcDIGIRR主要存在于细胞的膜质区;过表达LcDIGIRR能够显著抑制nf-κb及MyD88介导的nf-κb的转录激活。综上表明,Lcdigirr可能通过抑制nf-κb的转录激活,在大黄鱼的免疫反应中发挥负调控作用。对于深入理解大黄鱼的免疫反应机制具有重要意义。

甲壳动物血细胞及其在免疫防御中的功能

甲壳动物的免疫反应主要依靠吞噬、包囊和凝集,属于非特异性免疫。血细胞在甲壳动物的免疫系统中具有重要作用。造血组织和造血干细胞为血细胞的生成、补充和更新提供了保障。血细胞成熟后分为不同类型,对血细胞分型的研究正在从采用传统的形态学方法向采用生物技术方法的方向发展,单克隆抗体技术已经应用于血细胞分型,结果更为客观准确。不同类型的血细胞在细胞化学特性与功能方面表现出明显差异。在甲壳动物的免疫反应中,血细胞数量在不同的免疫应激状态下发生明显变化。当外来病原体较小时,血细胞通过吞噬作用吞入病原体,在细胞内部将病原杀灭;而当入侵的病原体或寄生虫的个体大于10μm时则以多个血细胞的包囊作用或凝集作用来完成。甲壳动物的免疫反应是一个交互作用的复杂过程,必然涉及多层次、多个因子的参与。其中造血组织的结构,血细胞的产生及调控机理,采用单克隆抗体技术对血细胞进行分型标准的建立,免疫因子在免疫反应中的功能及它们之间的相互作用的网络关系等尚需深入研究。

大黄鱼TLR25的分子结构及表达特征分析

克隆了大黄鱼TLR25(LcTLR25)基因的cDNA序列,采用荧光定量PCR检测了LcTLR25基因在大黄鱼不同组织中的表达,以及免疫诱导后的表达变化。结果显示:LcTLR25 cDNA序列长度为2868 bp,包含1605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸;预测蛋白质由5个LRR结构域、1个跨膜区和1个TIR结构域组成,主要定位于细胞膜;系统进化树分析表明,LcTLR25与其他硬骨鱼的TLR25基因聚为一支,与尼罗罗非鱼的TLR25序列同源性最高;定量PCR分析显示,LcTLR25在大黄鱼肠组织中表达量最高,但是在鳃、肝、胃及皮肤组织中未检测到其表达;LPS刺激后,大黄鱼LCK细胞系中LcTLR25基因表达量显著增加,在刺激后6 h达到最高值(P<0.05),随后逐渐恢复至对照组水平;而LcTLR25在Poly I:C刺激后6 h显著下降(P<0.05),随后逐渐恢复至对照水平。提示LcTLR25可能参与LPS诱导的免疫反应。

甲壳动物精氨酸激酶的结构与功能

精氨酸激酶(arginine kinase)是调节无脊椎动物能量代谢的重要酶,在调节无脊椎动物体内磷酸精氨酸与ATP之间的能量平衡过程中具有重要作用.甲壳动物是节肢动物门内最重要的类群之一,并具有重要的经济价值.来源于甲壳动物的精氨酸激酶是一个单亚基酶,现已得到了广泛研究.本文综述了甲壳动物体内精氨酸激酶的分子构象、序列特征、特异表达及生物学功能和分子结构与功能之间的关系等方面的研究进展,为深入研究甲壳动物的能量代谢调控机制提供必要的参考.另外,还对甲壳动物精氨酸激酶的重要性和研究中存在的问题进行了讨论.

凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析

精氨酸激酶(arginine kinase,AK)在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上,设计特异引物,以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版,克隆得到了1071bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框;将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化BL21(DE3)菌株,经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗血清,经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现,精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量,而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤组织中表达量较低。为进一步研究精氨酸激酶在对虾体内的功能奠定了基础。

凡纳滨对虾精氨酸激酶的分离纯化及性质研究

经过CM-纤维素批量层析、Separdex G-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析等步骤,从凡纳滨对虾肌肉组织分离得到精氨酸激酶,经SDS-PAGE检测达到电泳纯,分子量约为40kDa。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降;pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用,高浓度时表现抑制作用,而底物类似物精胺和氨基胍则对酶促反应表现出完全的抑制。NaCl,KCl对酶的活力具有促进作用,低浓度(10mmol.L-1)MgCl2对酶活力表现出激活作用,而CuCl2与MnCl2则表现出完全抑制酶活力,CaCl2与ZnCl2在低浓度时对酶活力无明显影响,但是随着浓度升高,对酶具有抑制作用。

虾类氨基酸营养需求的研究进展

氨基酸是虾类的重要营养素之一 ,其在虾的生长发育过程中起着重要作用。本文介绍了作为虾类饵料和诱食剂的氨基酸需求量研究的新成果 ,并对可供开发的氨基酸含量丰富的蛋白源做了总结 。

灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血液抗菌活性的变化

采用对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)人工注射灭活鳗弧菌,利用溶壁微球菌(Micrococcusluteus)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)作为测试菌株,对在抑菌活性检测中最为常用的抑菌圈法、辐射扩散法和液体培养基微量稀释检测法进行了技术改进并比较了它们的检测效果,并检测了阳离子交换柱层析法初步分离的中国明对虾血淋巴主要组分的抗菌活性,进行了细菌攻毒前后中国明对虾血浆及血细胞抗菌活性变化的研究。结果表明,液体培养基微量稀释检测法抑菌效果在三种方法中灵敏度最高,抑菌圈法灵敏度最低,但对于蛋白含量较高的样品,辐射扩散法被证明在抑菌活性检测方面更为适用。利用改进的辐射扩散法对灭活鳗弧菌攻毒前后的中国明对虾血细胞和血浆的抑菌活性进行了检测,结果显示,虽然感染后血细胞数目显著降低(P<0·05),但其抑菌能力却明显增强(P<0·05),相对而言,血浆抑菌活性变化不显著(P>0·05),说明血细胞在受到免疫刺激后抗菌因子的表达进一步加强。

不同生长时期大黄鱼形态性状与体重的相关性分析

研究不同生长时期大黄鱼Pseudosciaena crocea形态性状对体重的影响效果,分别测定了1704尾13月龄和596尾20月龄闽-粤东族大黄鱼的全长(x1)、体长(x2)、体高(x3)和体重(y),计算相关系数,采用通径分析方法计算了以体重(y)为依变量、其他性状为自变量的通径系数和决定系数。结果表明,在两个不同生长时期,全长、体长、体高和体重4个性状两两之间的相关系数在0.800-0.977之间,均达到极显著水平(P<0.01);在13月龄,体高对体重的直接影响(0.522)最大,其次为体长(0.445),全长对体重的直接影响不显著(P>0.05)。在20月龄,体高对体重的直接影响(0.394)最大,其次为体长(0.328)、全长(0.271),各性状对体重的直接影响均达到极显著水平(P<0.01)。研究结果表明在不同生长时期,各形态性状对体重的直接影响是不同的,早期选种(13月龄)时要注意体高和体长的挑选,而在晚些时候(20月龄)选种,对体高、体长和全长均要考虑,才能够保证选择效果。

大黄鱼连续4代选育群体遗传多样性与遗传结构的微卫星分析

利用13个多态性微卫星位点分析了大黄鱼"官井洋优快01"品系F1到F44个选育世代的遗传结构与遗传多样性变化情况。结果显示,随着选育的进行,4个世代群体遗传多样性指标值渐次下降,F1到F413个微卫星位点的平均多态信息含量从0.638下降到0.524,平均等位基因数从5.462下降到4.308,平均观测杂合度从0.779下降到0.532,平均Shannon多样性指数从1.356下降为1.092。F1与其后各代遗传相似系数逐渐减小(从0.7194到0.5813),遗传距离逐渐增加,而相邻世代间的遗传相似性逐步升高,遗传分化指数(FST)渐次变小(F1～F2为0.0619,F2～F3为0.0511,F3～F4则为0.0475)。随着选育的进行,微卫星位点LYC0002和LYC0054等位基因频率有规律地发生变化,推测其可能与选育性状存在遗传上的相关。结果表明,经过连续4代的选育,部分不利基因遭到淘汰,选育群体的遗传基础逐步得到纯化,基因型逐渐趋向纯合、稳定,经进一步的选育可望获得较稳定的品系。

大黄鱼连续两代雌核发育群体的微卫星标记分析

通过对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)异质雌核发育一代群体(meio-G1)与二代群体(meio-G2)微卫星位点的纯合度进行分析,研究异质雌核发育对大黄鱼基因纯化的效率。结果显示:meio-G1和meio-G215个微卫星座位的平均纯合度分别为0.661和0.803,纯合位点比例最高个体分别为0.867(13/15)和0.933(14/15),两个群体内个体间的平均相似系数分别为0.5903和0.8672,最高分别达0.9286和1.0(遗传距离为0.0741和0),远高于两性交配繁殖群体(平均纯合度0.376,平均相似系数0.4687,个体间最小遗传距离0.2288);其中meio-G2群体有7个位点(46.7%)已经完全纯合固定,并与普通养殖群体产生较明显的遗传分化;表明人工诱导异质雌核发育可大大加速大黄鱼大多数基因位点的纯合,是快速建立高纯品系的有效手段。但不同位点的纯合度差异很大,部分位点在异质雌核发育后代中迅速纯合,在meio-G1中就达到很高的纯合度,而有些位点则在meio-G1和meio-G2中仍保持很高的杂合度;meio-G1和meio-G2群体中不同个体纯合位点比例差异也很大。研究培育的雌核发育群体为大黄鱼进一步选育提供了良好的遗传材料。

海带多糖的抗衰老作用及其机理的研究

以果蝇(Drosophila melanogaster)作为试验动物,探讨了海带多糖(Laminaria japonicapolysaccharide,LJP)延缓衰老的作用及其机理。试验将未交配的果蝇雌雄分开并随机分成4组,每组100只,用含不同浓度海带多糖的培养基喂养,培养基中所含海带多糖的浓度分别为0(对照组)、0.25%、0.50%、1.00%。用果蝇寿命试验检测其抗衰老作用,分别使用邻苯三酚自氧化法、钼酸铵比色法、硫代巴比妥酸(TBA)法测定果蝇体内超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。利用统计学软件SAS v6.12对试验数据进行分析。结果表明:培养基中添加海带多糖能延长果蝇平均寿命,寿命延长的百分率与喂食果蝇的海带多糖浓度有一定的量效关系,培养基中海带多糖浓度为0.25%、0.50%、1.00%时,与对照组相比,雌果蝇寿命延长百分率分别为5.20%、6.20%、9.20%,雄果蝇寿命延长百分率分别为4.60%、5.00%、6.00%;饲喂海带多糖后果蝇体内的SOD、CAT活性提高,与对照组相比,海带多糖添加量为0.50%和1.00%时,雌性果蝇SOD、CAT活性提高量达到显著水平(P<0.05),MDA降低量达到显著水平(P<0.05);海带多糖添加量为1.00%时,雄性果蝇SOD与CAT活性提高量达到显著水平(P<0.05),MDA含量降低。提示提高生物体内抗氧化酶活力,降低衰老物质前体的含量可能是海带多糖抗衰老的途径之一。

鱼类Toll样受体及其信号传导的研究进展

鱼类是脊椎动物中的一个重要类群,在其生存与进化的过程中,免疫系统担负着保护鱼类免受病原感染的重任,其中Toll样受体家族等介导的先天性免疫是鱼类抗病免疫的第一道防线,并在连接先天性免疫与获得性免疫反应中起着桥梁作用。虽然从无脊椎动物到高等脊椎动物,Toll样受体家族内多数成员在蛋白质结构与功能上都较为保守,但是鱼类作为最低等的脊椎动物,在其进化过程中又形成了一些特有Toll样受体分子,其剪接类型也更丰富;鱼类Toll样受体家族介导的免疫识别、免疫信号传导、激活和调控方式与高等脊椎动物也不尽相同。文章主要综述了鱼类Toll样受体的结构、种类、功能、多样性、免疫信号传导及其调控特点,为深入了解鱼类的免疫反应奠定基础。

大黄鱼同质雌核发育的诱导及微卫星标记分析

为了解大黄鱼同质雌核发育的诱导条件及其效果,用紫外线照射灭活大黄鱼精子的遗传物质,静水压休克抑制第一次卵裂,培育出2个同质雌核发育家系(GF1和GF2),并借助微卫星标记进行鉴定,研究了10个母本中杂合的位点在2个家系中的传递和分离。结果显示,GF1和GF2孵出的仔鱼中分别有40.0%和17.1%形态正常个体,GF1检测8个位点30个个体均表现出雌核发育双单倍体(GDH)的特征,有20种基因型;GF2检测4个位点30个个体中,27个为GDH,2个含有父本基因,余下1个个体扩增条带既不同于母本也不同于父本,遗传本质不明。可见,所采用方法可以诱导出同质雌核发育大黄鱼。10个标记中除了LYC0026和LYC0053标记在GF2中偏离了1∶1(P<0.05),其余标记在GDH中的分离均符合孟德尔遗传定律的预期比值。研究还发现LYC0002和LYC0014的分离模式完全相同。首次报道了大黄鱼同质雌核发育的人工诱导及微卫星标记在GDH中的传递与分离,为大黄鱼纯系培育及利用GDH与纯系进行基因组作图分析等研究奠定了基础。

用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶

采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶 ,粗酶液比活达8.20×10-8 mol/(s·mg) ,比超声波法高10倍以上 ,酶活总收率达93.3 %。

外源水杨酸对镉胁迫下月季叶片超弱发光的影响

通过对月季叶片超弱发光强度及SOD活性和MDA含量测定,结果表明:当外源水杨酸浓度达到50mg.L-1时,SA可以缓解镉对月季叶片的胁迫作用,降低活性氧的含量,并减弱月季叶片延迟发光的强度,同时也表明植物体内活性氧的含量改变与植物延迟发光的衰减趋势有着直接的联系。

镧对镉胁迫下月季叶片超弱发光的影响

[目的]研究镧对镉胁迫下月季叶片的缓解作用及对其超弱发光的影响。[方法]同时用50 mg/L镉和不同浓度的镧(40、60、80mg/L)处理月季叶片,测定叶片的自发光和延迟发光的强度及SOD活性和MDA含量。[结果]月季叶片经24 h培养后,各处理与空白对照相比,自发光变化趋势无明显规律。镉对月季叶片产生了胁迫,一定浓度的镧具有缓解镉胁迫的作用,60 mg/L的镧作用最为显著。镉胁迫促使月季叶片SOD活力显著降低,用镧处理后SOD活力没有显著差异。镉促进月季叶片中MDA含量的增加,随着镧浓度的升高MDA含量趋于正常。[结论]在镉的胁迫下月季叶片的延迟发光强度增加、SOD活力降低、MDA含量上升,镧处理后其延迟发光强度明显降低、MDA含量趋于正常,但SOD活力变化不显著。

大黄鱼选育群体与普通养殖群体部分免疫指标的比较

以本课题组选育的"闽优1号"及未经选育的普通大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖群体为研究对象,比较了两者的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、杀菌活力、白蛋白及免疫球蛋白含量、血清及血细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性等免疫指标的差异。结果表明:选育的"闽优1号"大黄鱼血清溶菌酶和血细胞SOD活力显著高于对照组(P<0.05),而血清中的免疫球蛋白含量低于普通养殖群体。在病原菌攻毒后8 d内,选育群体累积死亡率显著低于非选育群体,提示非特异性免疫在大黄鱼抗病免疫的早期阶段可能起着重要作用。