阿卡斑病毒研究进展

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)可感染多种家养动物及野生动物,引起动物流产、早产、死胎、胎儿先天性畸形及脑脊髓炎等临床症状。AKAV以蚊虫和库蠓为主要传播媒介,已在多个国家地区被报道,严重影响家畜养殖业并造成了较大的经济损失。因AKAV分布广泛,危害较大,其感染引起的阿卡斑病(Akababe disease,AKAD)已是世界动物卫生组织(WOAH)法定通报的疾病之一。对AKAV的病原学、流行病学、临床症状、致病机制及诊断方法进行综述,以期为AKAD的预防与控制提供参考。

禽戊型肝炎病毒CaHEV-GDSZ01株ORF3蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

旨在对禽戊型肝炎病毒的ORF3蛋白进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为进一步研究aHEV ORF3蛋白生物学功能新型疫苗提供生物材料。通过RT-PCR方法扩增CaHEV-GDSZ01株ORF3基因,连接pET-32a(+)表达载体以构建重组原核表达质粒,并转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达;利用SDS-PAGE凝胶电泳分析ORF3蛋白的表达形式后进行纯化,并免疫新西兰白兔以获得兔抗ORF3蛋白多克隆抗体,利用间接ELISA试验检测多克隆抗体的效价,利用Western Blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体特异性。结果显示,成功构建了pET-32a-ORF3重组原核表达质粒,并通过原核表达系统成功诱导表达了27 ku不可溶性的aHEV ORF3重组蛋白;Western Blot试验和IFA试验结果显示,制备的多克隆抗体可以特异性识别ORF3蛋白,ELISA结果显示,多克隆抗体效价为1∶51 200。成功表达CaHEV-GDSZ01株的ORF3蛋白,并制备了其多克隆抗体。

水禽圆环病毒巢式PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种快速、灵敏、特异的水禽圆环病毒检测方法,试验根据GenBank中已公布的鸭圆环病毒(DuCV)和鹅圆环病毒(GoCV)的Rep基因序列设计3条特异性引物,对扩增条件进行优化,并检验优化后方法的特异性和灵敏性,最后用建立的水禽圆环病毒巢式PCR检测方法对40份疑似水禽圆环病毒感染的病料进行检测。结果表明:水禽圆环病毒巢式PCR方法可成功扩增出719 bp和543 bp的目的片段;优化后的一轮、二轮PCR中退火温度分别为50,56℃,引物加入量均为0.6μL,二轮PCR的模板稀释倍数为1×10^(3)倍。优化后的方法对水禽圆环病毒的检测具有较好的特异性,与鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、H5N6亚型禽流感病毒(AIV)、H9N2 AIV、新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DEV)、鹅细小病毒(GPV)及鹅星状病毒(GoAstV)均无交叉反应;该方法的最低检出限达4.04×10^(2)拷贝/μL,分别是一轮、二轮PCR最低检出限的1×10^(4),1×10^(3)倍;利用该方法对肝脏病料进行检测,GoCV的阳性率为60%(12/20),DuCV的阳性率为40%(8/20)。说明试验建立的巢式PCR检测方法可用于水禽圆环病毒的检测。

鹅星状病毒病原学、流行病学及宿主免疫应答的研究进展

雏鹅痛风病主要是由鹅星状病毒引起尿酸盐沉积的代谢性疾病。近年来,鹅星状病毒感染在我国各大鹅养殖地区广泛流行,耐过雏鹅表现为体重减轻、生长缓慢及易受其他病原感染,目前仍未能有效控制,给养鹅业带来了巨大的经济损失。鹅星状病毒是一种无囊膜单股正链RNA病毒,基因组约为8.0 kb,对外界环境抵抗能力较强,且多宿主均可感染。目前无合适的体外增殖系统,阻碍了鹅星状病毒病的防控进程。文章通过对鹅星状病毒病原学、流行病学及宿主免疫应答等方面进行综述,为该病致病机制的深入研究及有效防控手段开发提供依据。

鸭圆环病毒编码蛋白功能研究进展

鸭圆环病毒病是一种重要的免疫抑制性疾病,可引起鸭各免疫器官损伤及淋巴细胞严重减少,大大增加了病原菌混合感染的概率,给养鸭业带来严重的经济损失。鸭圆环病毒基因组为单股环状DNA,主要编码3种蛋白,分别为Rep蛋白、Cap蛋白及与细胞凋亡有关的ORF3蛋白。研究病毒编码蛋白的功能对于病毒致病机制研究及相关疫苗的研制具有重要作用。本文就鸭圆环病毒目前已知编码的蛋白功能进行详细地叙述,以期为鸭圆环病毒病的致病机制研究及防控提供参考。

2株3型鸭甲肝病毒广东分离株的鉴定与遗传进化分析

为了解广东省某两个养殖场发生的疑似鸭病毒性肝炎病例感染的病原体,试验对两个养殖场送检的2份病料采用RT-PCR、病毒分离和序列分析等方法对病毒进行鉴定;病料处理后接种10日龄SPF鸭胚、9日龄SPF鸡胚尿囊腔进行病毒分离,并扩增病毒全基因组及VP1基因,利用DNAStar 7.0和MEGA Ⅹ对分离株与GenBank中公布的相关病毒株序列进行同源性比对、氨基酸序列比对并构建系统进化树。结果表明:从病料中成功分离并鉴定2株3型鸭甲肝病毒(DHAV-3),分别命名为GD18株和GD21株;2份病料攻毒均未引起鸡胚的死亡与明显病变,但引起了鸭胚的发育不良,且GD21株可引起鸭胚死亡,死亡胚体出现全身性出血、充血等特征性病变;分离的2株DHAV-3均属于GⅠ基因型,且与之前在广东省流行的FS株、GD株和C-GY株等毒株亲缘关系较远,而与广东省外流行毒株SD株、JS株、CH株和EY株等亲缘关系较近。与参考株氨基酸序列比对,GD18株在第49位和第67位出现2个新的突变位点,而GD21株没有出现新的突变位点。说明在广东省内鸭群中可能存在由于引种或贸易过程而引入的DHAV-3新毒株的流行。

禽戊型肝炎病毒研究进展

禽戊型肝炎病毒(Avian hepatitis E virus,aHEV)是引起鸡大肝大脾病或肝炎脾大综合征的主要病原,自2016年以来,我国出现了新基因型aHEV的流行,可感染更低日龄鸡群,并引起不同于以往的临床症状,给养殖业造成严重的经济损失。aHEV的宿主范围广泛,除了感染鸡、火鸡等常见家禽外,还能感染野外其它禽类与家猪等,有潜在的人兽共患风险。近年来,在aHEV与宿主细胞相互作用、疫苗研制等方面取得了一定的进展,文章就aHEV的病原学、流行病学、病毒与宿主细胞相互作用及疫苗研制等方面的研究进展进行综述,以期为未来aHEV的深入研究及引起的相关疾病的综合防控提供参考。

鸭坦布苏病毒SCCD2020株的分离鉴定及其E基因、NS1基因序列分析

为确诊四川某鸭场11日龄樱桃谷雏鸭死亡原因,本研究采集送检鸭只的肝、脾、脑组织,经研磨处理,利用BHK-21细胞及鸭胚成纤维细胞培养及RT-PCR鉴定,从送检的疑似鸭坦布苏病毒感染的病料中分离出一株鸭坦布苏病毒,将其命名为SCCD2020株。利用PCR方法对分离株E基因及NS1基因进行克隆,并对两基因序列进行分析,结果显示,E基因和NS1基因全长分别为1503 bp和1062 bp。将两基因序列分别与GenBank已发布的26株坦布苏病毒的相应序列进行比对分析,结果显示两者核苷酸序列未出现变异及缺失,SCCD2020分离株的E基因与鸭源DTMUV-H株同源性高达99.2%,与鹅源分离株同源性为96.4%,与鸡源分离株同源性为86.7%。E基因遗传进化分析结果显示,SCCD2020分离株位于中国和泰国流行的Ⅱ群毒株中,与Ⅱ群毒株同源性达96.2%,属于近年来国内DTMUV流行毒株之一。NS1基因序列比对及遗传进化分析结果和E基因类似。研究结果为进一步了解我国目前流行的鸭坦布苏病毒的基因组特征及流行病学研究提供数据支撑。

新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在利用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)DH13株重组σB蛋白,并检测其免疫原性,为NDRV基因工程疫苗研制等提供物质材料。采用RT-PCR方法扩增获得NDRVσB基因,构建原核表达重组质粒pET-30a-σB和pET-32a-σB,将2个重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式。纯化无His的σB蛋白,并以此蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,制备兔源多克隆抗体。利用Ni2+柱亲和层析法纯化含His的σB蛋白,以此蛋白作为检测原,通过间接ELISA方法测定兔源多克隆抗体效价;Western blotting鉴定多克隆抗体与重组蛋白的特异性识别能力。结果显示,PCR扩增获得大小约为1100 bp的σB基因片段。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了2种重组σB蛋白,大小分别约为41和46 ku,均以包涵体形式存在。间接ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶204800,能特异性地识别原核表达的重组蛋白,表明重组无His的σB蛋白具有良好的免疫原性。Western blotting特异性鉴定结果显示,含His的σB蛋白和无His的σB蛋白均与制备的兔源多克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达得到的重组σB蛋白具备良好的反应原性。本试验利用原核表达系统成功地表达出了重组σB蛋白,并证实了重组NDRVσB蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该结果将有助于后续对NDRVσB蛋白生物学功能的鉴定、NDRV诊断用抗原的制备及NDRV新型疫苗的研制。

基因Ⅱ型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

旨在利用原核表达系统表达基因Ⅱ型鹅星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)ORF2蛋白,制备兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。根据GoAstV-GDZJ37株ORF2基因序列设计特异性表达引物,利用RT-PCR方法进行目的基因扩增,将其连接至原核表达载体pET-32a(+);经酶切鉴定和测序正确后,转化至表达感受态细胞,并进行诱导表达及SDS-PAGE分析。以无His标签的ORF2蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体。将含His标签的ORF2蛋白经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后的蛋白作为检测原,通过I-ELISA方法检测兔源多克隆抗体的效价,并通过Western blot及IFA检测方法鉴定其特异性。结果显示,克隆获得GoAstV-GDZJ37株ORF2基因,并利用原核表达系统分别表达2种重组蛋白,大小分别为77、95 kDa,且均为不可溶性表达。I-ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶102400,表明无His标签的ORF2蛋白具有良好的免疫原性;Western blot及IFA结果显示,多克隆抗体可与含His标签的ORF2蛋白及GoAstV毒株均能发生特异性反应,表明制备的多抗具有良好的反应性。本试验成功建立GoAstV ORF2蛋白原核表达系统,并制备高效价兔源多克隆抗体,为后续GoAstV血清学诊断及GoAstV致病机制的深入研究提供了依据。

鹅4种常见病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种能快速检测鹅星状病毒(GoAstV)、鹅圆环病毒(GoCV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank数据库已公布的GoAstV的ORF2基因、GoCV的Rep基因、GPV的VP3基因及DTMUV的NS5基因序列,分别设计4对特异性扩增引物,通过对扩增条件的优化及特异性、灵敏性的检验,建立了可同时检测以上4种病原的多重PCR检测方法,并对40份临床样品进行检测。结果显示,建立的多重PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏性,可同时扩增出大小为731 bp(GoAstV)、543 bp(GoCV)、392 bp(GPV)、200 bp(DTMUV)的特异性片段,且利用本试验建立的多重PCR检测方法对水禽其他病原体进行扩增均呈阴性。该方法对GoAstV、GoCV、GPV及DTMUV最低检出限度分别为4×10^(3),4.22×10^(3),4.43×10^(3),4.73×10^(3)copies/μL。单一PCR检测方法对临床病料样品检测结果与多重PCR检测结果一致,证明该方法可用于这4种病原临床病料样品的检测。