绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究

根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR序列 ,分别设计两对特异引物primersPxyF R和primersgfpF R ,扩增获得了完整的启动子PxylR和gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板 ,以primerPxyF primergfpR做引物进行重迭PCR ,获得了PxylR gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后 ,将PxylR gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP2 2。相应的重组表达质粒pGFP315和pGFP2 2转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株 16 8中得到良好发光表型 ,后者则在标准菌株 16 8和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异 ,遗传稳定性研究表明连续稀释培养约 175代后 ,工程菌株稳定性为 94 % ,质粒丢失频率低于 3 5× 10 - 4 代。

重组抗血红素ScFv包涵体蛋白的复性及纯化研究

抗血红素多二硫键ScFv在大肠杆菌中绝大多数表达产物为包涵体,为了获得可溶性的具有生物活性的ScFv,摸索了不同的复性条件,包括透析法、稀释和层析相结合的方法。研究发现,先对溶解的变性ScFv溶液稀释,进行初步的蛋白质复性,再利用Sephadex G-25凝胶层析进一步复性、降低变性剂浓度和纯化,至少可以得到95％纯度,产率为150mg／L的目标蛋白,通过一次凝胶过滤层析,达到了去除变性剂、复性及纯化ScFv蛋白三种目的,为多二硫键ScFv在大肠杆菌中的表达和纯化提供了一种经济可行的方法。