缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮关联SNP验证及相关基因NKA在氨氮胁迫下的表达特征分析

为筛查和验证缢蛏(Sinonovacula constricta)耐氨氮相关单核苷酸多态性(SNP)和基因,为分子标记辅助育种提供参考,通过竞争性等位基因特异性PCR(KASP)对位于缢蛏NKA基因(Sc-NKA)下游的SNP(g.21062868T>A)进行验证,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测高氨氮胁迫下Sc-NKA基因的表达水平,用免疫荧光技术对Sc-NKA蛋白进行组织细胞定位,通过RNA干扰探究Sc-NKA基因在氨氮排泄中的作用。结果显示,SNP位点(g.21062868T>A)与氨氮耐受性状显著相关(P<0.05);Sc-NKA基因在氨氮胁迫后的mRNA和蛋白表达量均显著增加(P<0.05);缢蛏鳃中的柱状细胞和扁平细胞是Sc-NKA蛋白分泌的主要部位,且在氨氮胁迫后细胞中的蛋白丰度增加;干扰Sc-NKA基因6~48 h后,缢蛏血淋巴中氨含量显著升高(P<0.05),且Na^(+)-K^(+)-2Cl共转运蛋白1(NKCC1)的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。这些研究结果表明,Sc-NKA参与氨氮的排泄过程,且与NKCC1在氨氮转运中具有协同作用。

泥蚶4个快速生长家系的遗传变异分析

利用AFLP分子标记技术对泥蚶4个快速生长家系(J5♂×Z19♀、Z7♂×J26♀、S1♂×Z3♀、S6♂×Z22♀)的遗传结构及遗传差异进行了分析。用筛选出的9对引物组合在4个家系共124个个体中扩增出506个位点,多态位点比例72.53%。遗传结构分析表明,4个家系的多态位点比例为51.14%～60.75%。从Nei基因多样性指数和Shannon’s信息指数反映的遗传多样性来看,4个家系的遗传多样性由大到小依次为J5♂×Z19♀>S6♂×Z22♀>S1♂×Z3♀>Z7♂×J26♀。基因分化系数GST和AMOVA分子方差分析表明,遗传变异主要来源于家系内个体间。4家系间总遗传分化指数FST=0.383 7,说明家系间已发生了一定程度的遗传分化。遗传距离和聚类分析表明,J5♂×Z19♀与其它3个家系间的遗传距离均较大(0.120 1～0.125 4),单独分出一支,而S1♂×Z3♀与S6♂×Z22♀间的遗传距离最小(0.089 6),首先聚在一起。另外,在4个家系的指纹图谱中找到了40个特征性标记,可作为家系鉴别的分子标记。依据家系的遗传多样性和遗传差异分析,可有效预测快速生长家系选育的最佳亲本配组,为分子标记辅助泥蚶家系选育提供科学理论依据。

泥蚶奉化种群与韩国种群形态特征和遗传结构的差异分析

利用形态学标记和微卫星标记技术,研究了泥蚶奉化种群和韩国种群的壳形态和遗传结构的差异,为泥蚶良种培育提供科学依据。对同批2龄泥蚶奉化种群和韩国种群的壳长(SL)、壳高(SH)、壳宽(SW)、壳顶宽(SRW)、总质量(TW)、软体部质量(IW)进行测量,以各性状的相对比值作为形态分析指标,考察了SH/SL、SW/SL、SRW/SL、IW/TW 4个指标的差异。方差分析和Tukey多重比较结果表明,韩国种群的SW/SL、SRW/SL 2个形态指标均极显著高于奉化种群(P<0.01),表明韩国种群的壳型比奉化种群更加鼓胀;IW/TW极显著高于奉化种群,表明韩国种群的软体部含量高,即出肉率高。选用6个高度多态的微卫星标记分析了泥蚶韩国种群和奉化种群的遗传差异,结果 6个微卫星位点在2个种群中共检测出64个等位基因,其中5个位点的PIC值>0.5,表现出高度多态性;遗传多样性分析表明,奉化种群和韩国种群在等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等遗传参数上差异很小,遗传分化系数Fst为0.022;但2个群体的遗传距离为0.136 7,在TMP18、ETG7等位点的等位基因数和期望杂合度等参数上存在显著差异,表明2个种群的遗传结构已经发生了一定程度的变异。

泥蚶乙二醛酶Ⅰ基因的克隆及时空表达特征分析

为探索贝类乙二醛酶Ⅰ基因的结构及功能特征,实验利用RACE技术首次克隆获得泥蚶乙二醛Ⅰ基因（Tg-GLOI）的cDNA全长序列,并对其氨基酸序列特征及时空表达特征进行了研究。结果发现,Tg-GLOI基因的cDNA全长序列为1 807 bp,开放阅读框为540 bp,编码180个氨基酸,在27～169 aa处具有典型的乙二醛酶系保守序列;成熟的乙二醛酶Ⅰ由2个相同的亚基组成,每个亚基由乙二醛Ⅰ基因编码,其二级结构由18个α-螺旋、20个β-折叠片和36个转角组成,每个亚基各含1个Zn2＋;氨基酸序列比对发现,Tg-GLOI氨基酸序列与太平洋牡蛎的同源性达到86.1%,与其他脊椎动物的同源性也都在70%以上,表现出高度保守性。qRT-PCR结果显示,Tg-GLOI基因在泥蚶成贝8个组织中均有表达,在内脏团中的表达量最高,极显著地高于其他组织（P〈0.01）;在各发育时期中,Tg-GLOI表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势,在眼点幼虫期达到最高,极显著高于其他时期（P〈0.01）,而在幼虫变态至稚贝时,表达量又极显著地下降（P〈0.01）。研究表明,Tg-GLOI具有类似于高等动物的分子结构,并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达差异显著,这为进一步研究该酶在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。

泥蚶34个EST-SSR标记的开发及在格粗饰蚶中的通用性检测

利用泥蚶转录组高通量测序、拼接获得的大量EST序列开发SSR标记,在1 123条EST序列里筛查到73条含有SSR位点的EST序列,其中54个位点适合设计引物,在位点两侧设计引物并进行PCR扩增。结果显示,46对引物获得稳定扩增的位点,引物在泥蚶奉化群体的多态性检测中发现,有34对引物表现出多态性,共扩增出122个等位基因,各位点的等位基因数Na为2～7个,平均每个位点产生3.59个等位基因,观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000～0.600、0.078～0.771、0.106～0.718;Hardy-Weinberg平衡检测显示,13个位点偏离了平衡状态;用Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库对含有多态性SSR的EST进行了基因注释,25个SSR位点来自注释基因序列。将34对泥蚶多态性SSR引物在格粗饰蚶中进行了通用性检测,结果有11对成功扩增,8对表现为多态,通用率为23.53%,这些通用引物可用于两种蚶的遗传多样性评价、系统进化分析、比较作图和基因发掘等研究。

文蛤30个微卫星标记的开发及在斧文蛤和帘文蛤中的通用性检测

为开展文蛤多态性微卫星标记及其在斧文蛤和帘文蛤中的通用性研究,实验从磁珠富集法构建的基因组文库和EST文库中开发了30个文蛤多态性微卫星标记,包括8个G-SSR和22个EST-SSR多态性位点。共获得140个等位基因,平均等位基因数为4.67;多态性信息含量、观测杂合度、期望杂合度分别为0.172～0.744、0.040～0.720、0.187～0.793;G-SSRs的平均等位基因数、平均多态性信息含量、平均观测杂合度和平均期望杂合度都较EST-SSRs高;Hardy-Weinberg平衡检测发现,24个位点偏离了平衡状态;利用BLASTx对含多态性SSR位点的EST进行功能注释,11个位点来自注释基因序列。将30对文蛤多态性SSR引物分别在斧文蛤和帘文蛤中进行了通用性检测,通用率分别为40%和30%。这些微卫星多态性位点的获得,为进一步开展文蛤遗传多样性分析、种质资源评价、分子标记辅助选育等奠定了基础,并且可用于文蛤、斧文蛤和帘文蛤的比较作图、基因发掘和QTL定位等研究。

利用微卫星标记对文蛤4个壳色花纹品系的遗传分析

利用9个微卫星位点对文蛤红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF)4个壳色花纹品系共120个个体进行遗传差异分析。结果共检测到105个等位基因,每个位点平均观察等位基因数为11.7个,其中WG07位点等位基因数最多(21个),WG11位点最少(7个)。每个品系均具有特异等位基因类型,不同品系中相同微卫星位点的等位基因分布规律不同。4个文蛤品系的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量变异范围分别为0.110～1.000、0.486～0.867、0.433～0.834,均属高度多态性位点。Hardy-Weinberg平衡的卡方检测发现,大多数位点偏离平衡状态;聚类分析表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其它品系的遗传距离最大,DF品系和RS品系的遗传距离相对较小。

泥蚶生长性状相关AFLP分子标记的筛选

以浙江乐清泥蚶养殖群体为育种基础群,经过2代连续选育获得了泥蚶快速生长品系,生长对比试验发现其在壳长、壳高、壳宽、总体质量等性状上都表现出了显著的生长优势。为了研究快速生长品系的遗传结构并筛查生长性状相关的分子标记,利用AFLP标记技术对泥蚶快速生长品系和对照组群体的基因组DNA进行了PCR扩增和电泳检测。采用40对多态性丰富的引物组合在64个个体中共扩增出2180条带谱,扩增位点总多态性比例达85.6%。从Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数反映的遗传多样性来看,选育品系的遗传多样性略高于对照组群体。群体遗传分化系数GST(0.0224)和基因流Nm(22.2811)数据显示,两群体间遗传变异很小,存在明显的基因流动。通过比对AFLP指纹图谱的位点差异,在2180条扩增带中共筛选出了7个显著性差异位点,其中2个位点只在选育品系中出现,2个位点在选育品系中出现的频率极显著高于对照组(P<0.01),另有3个位点在对照组中出现频率显著高于选育品系(P<0.05)。据此初步确定这些位点为与生长性状相关的候选标记。

斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化

采用电镜和荧光显微镜技术,对斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化进行了系统研究。电镜观察表明,斧文蛤精子为鞭毛型,全长45.2～47.7μm,由头部、中段和尾部三部分组成。头部呈稍弯曲的狭茧形,长约2.5μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈圆锥形,内部中轴处有亚顶体腔;细胞核为长锥形,有核前窝和核后窝。中段由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个近球形的线粒体呈单层梅花状排列;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,远端中心粒延伸出尾部的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用荧光显微镜观察了斧文蛤受精及早期卵裂过程的细胞学变化,结果发现,斧文蛤成熟未受精卵呈圆球形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温27～28℃条件下受精,受精后6 min,精子入卵并膨胀成球形;受精后12～15 min、20～25 min受精卵排出第一、第二极体;30 min左右,精、卵核膨胀形成雄、雌原核;35 min,两性原核在卵子中央发生染色体联合;40～45 min,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的分裂球;55～60 min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,核相变化与第一次卵裂基本相同;75～80 min,第三次卵裂完成,自此次起开始进行螺旋分裂。另外,在斧文蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象,其对成熟分裂和早期卵裂过程影响很大,常造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库,利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列,并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明,泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp,开放阅读框为708bp,编码236个氨基酸;蛋白结构预测显示,Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域,SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成,SH3结构域主要由β-折叠片组成,具备典型的结构特征;氨基酸序列比对发现,Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%,而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示:Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达,而在血液中的表达量极显著地高于其它组织;在泥蚶的不同发育阶段中,Tg-GRB2 mRNA在2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量,而在D形幼虫中表达量最高,表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。

泥蚶(Tegillarca granosa)基因组SSR和EST-SSR的开发及比较研究

采用SSPHunter软件在泥蚶(Tegillarca granosa)磁珠富集文库和454转录组文库中搜索核心序列长度12bp以上的2—6核苷酸重复序列,根据富集文库所得基因组SSR侧翼序列设计47对引物,可成功扩增17对且均为多态性引物,多态率100%,平均等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性信息含量(PIC)分别为6.8、0.468、0.785、0.733。11344条EST序列中得到1683个SSR位点,检出率14.83%,平均每3.85kb出现1个位点。根据部分EST序列设计120对引物,62对可扩增出目的片段,其中29个位点具有多态性,多态率为46.77%,平均Na、Ho、He、PIC分别为4.2、0.372、0.554、0.500,均低于基因组SSR。双变量相关性分析的结果表明,46个多态性SSR位点的核心序列长度与其Na、Ho、He、PIC极显著正相关,Spearman相关系数分别为0.632、0.387、0.657、0.

泥蚶(♀)×毛蚶(♂)受精及胚胎发育过程的初步研究

以泥蚶为母本、毛蚶为父本,运用同步催产法,同时收集泥蚶的卵和毛蚶的精子进行人工杂交,采用普通光镜和荧光显微镜,对泥蚶(♀)×毛蚶(♂)受精及胚胎发育的细胞学过程进行了连续观察。结果显示,毛蚶的精子可以附着并穿过泥蚶的卵膜进行受精,并激活卵子减数分裂使其释放第一极体(PB1)和第二极体(PB2),能够形成雌、雄原核并发生原核联合,接着受精卵开始进行卵裂;杂交受精率统计为60.2%,发育速度较自交组慢;杂交胚胎发育前两次卵裂发育基本正常,后期才出现明显畸形;囊胚期持续时间很长,只能发育到担轮幼虫期,且纤毛越来越长,最后全部死亡。另外,在实验中发现有多精入卵和多极分离现象。

3种壳色花纹文蛤常规营养成分分析与评价

本试验对红壳、黑斑、白壳3种壳色花纹文蛤的常规营养成分进行了检测,旨在分析和评价不同壳色花纹文蛤在营养价值上的差异。解剖取软体部,采用国家标准方法测定组织中水分、粗蛋白质、粗脂肪含量以及氨基酸、脂肪酸组成。结果表明：文蛤软体部鲜样中水分含量为81.15%-81.89%,粗蛋白质含量为9.23%-9.71%,粗脂肪含量为1.31%-1.91%,其上述常规营养成分的含量在3种文蛤中均不存在显著差异（ P〉0.10）。采用酸水解法,在3种文蛤软体部干样中均检测到17种氨基酸,其中总氨基酸（ TAA）含量为42.95%-48.45%,鲜味氨基酸（ DAA）含量为17.44%-20.88%,且DAA含量红壳文蛤有高于白壳文蛤的趋势（ P〈0.10）；3种文蛤软体部中第一限制性氨基酸均为缬氨酸。在3种文蛤软体部干样中检测到22-23种脂肪酸,其中多不饱和脂肪酸（ PUFA）含量为36.07%-39.55%,C20∶5（ n-3）（ EPA）含量为11.37%-12.87%, C22∶6（n-3）（DHA）含量为9.82%-12.44%,其中 EPA 含量红壳文蛤有高于白壳文蛤的趋势（P〈0.10）,DHA含量红壳文蛤有高于白壳文蛤和黑斑文蛤的趋势（P〈0.10）。由此可见,本试验检测的3种文蛤营养价值均较高,其中以红壳文蛤最高,且其鲜味度最优。

文蛤(Meretrix meretrix)4个壳色花纹品系的遗传差异分析

应用AFLP技术对文蛤红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF)4个壳色花纹品系进行遗传差异分析。利用15对AFLP引物组合对4品系共128个个体进行了PCR扩增和电泳检测,共得到789个位点,总多态位点比例90.75%。Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数显示,4个品系的遗传多样性大小依次为BS品系>RS品系>DF品系>TC品系。AMOVA分析表明,79.45%的变异来自品系内,品系间的变异只占20.55%。聚类分析结果表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其他品系的遗传差异最大,DF品系和RS品系的遗传差异相对较小。发现1个TC品系特有的AFLP标记,其出现频率为1.000,可作为品系鉴别的特征性标记。

文蛤生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因克隆、时空表达及SNP位点筛查

为探索贝类GRB2基因的结构、功能特征,以及在贝类生长发育过程中的作用,实验通过已构建的文蛤转录组文库,利用SMART RACE技术扩增得到了文蛤GRB2基因的c DNA全长序列,对其生物信息学、组织及发育阶段表达特征进行了分析,并利用直接测序方法在外显子中筛选SNP位点。结果显示,GRB2基因c DNA全长1 791 bp,开放阅读框669 bp,编码223个氨基酸,蛋白由SH-SH2-SH3 3个结构域组成;氨基酸序列比对发现,文蛤G RB2与泥蚶的同源性最高,达到65.6%,与脊椎动物的同源性都在60%以上,说明GRB2基因在进化过程中比较保守。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)结果表明,GRB2在文蛤6个组织和10个发育时期中均有表达,但不同组织间的表达量并没有显著差异;发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势,在壳顶幼虫时期达到最高,之后表达量又有所降低。SNP位点的筛选结果表明,在G RB2基因的外显子区域共发现16个SNP位点。

浙江和广西两种文蛤的分子鉴定及形态特征分析

以文蛤如东群体(RD)和北海群体(BH)为对照群,利用线粒体COⅠ基因序列分析技术对苍南文蛤(CN)和北海白壳文蛤(BW)进行了分子鉴定。结果表明,苍南文蛤和斧文蛤的碱基组成非常相似,通过文蛤属贝类基因序列同源性比对和分子系统聚类分析发现,苍南文蛤CN1、CN2与斧文蛤的同源性分别达到100.0%、99.2%,在依据遗传距离构建的系统进化树上,2个苍南文蛤也与斧文蛤单独聚为一支,据此将苍南文蛤确定为斧文蛤,此结果将斧文蛤的分布区域向北扩展到了浙江南部沿海,修正了现有文献中记载的仅在我国南海诸省分布的说法;而白壳文蛤与其它6种文蛤的基因序列同源性都不高(79.6%～85.3%),在系统进化树上单独分出一支,明显是独立于这些文蛤之外的新种。斧文蛤、白壳文蛤与文蛤群体COⅠ基因的遗传多样性分析显示,文蛤BH群体的变异位点数、单倍型数和核苷酸多样性指数均最大,斧文蛤其次,而白壳文蛤10条基因序列完全相同,未发生任何核苷酸位点变异,说明其遗传多样性很低。应用方差分析和Tukey多重比较,分析了斧文蛤、白壳文蛤与文蛤群体的形态差异,发现斧文蛤的壳长明显大于壳高,且SMW/TW、IW/TW 2个参数与文蛤、白壳文蛤群体差异显著(P<0.05);而白壳文蛤的壳宽指数大、壳型相对膨胀,SW/SL和SW/SH值均最大,与文蛤和斧文蛤群体差异显著(P<0.05)。本研究结果可为文蛤属贝类种间鉴别、种质资源保护及系统进化研究提供基础资料。

缢蛏受精和早期卵裂过程的细胞学变化观察

采用普通光镜、荧光显微镜和石蜡切片技术,对缢蛏受精和早期卵裂过程中的精子入卵、减数分裂、雌雄原核形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学事件进行了显微观察。结果表明,缢蛏成熟未受精卵多呈圆球形或卵圆形,少数呈梨形,卵径为82～88μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为典型的原生型,全长55～58μm,头部呈保龄球形,顶体前端的顶体杆呈特别细长的花丝状;在水温21～22℃、盐度10的条件下进行人工授精,精、卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,启动卵子发育;受精后4～6 min,精子的头部已进入卵内并明显膨胀,卵子外形变圆,卵外附着的精子量明显减少;在受精后12～15 min、20～25 min,受精卵先后排出第一极体、第二极体,完成两次成熟分裂;第二次成熟分裂结束以后,精、卵核体积迅速膨胀,雄原核的膨胀早于雌原核,核膜重建,在受精后约30 min形成雌、雄原核;雌、雄原核均向卵子中央移动,雄原核旁边的精子星光清晰可见,随后二者在卵子中央以染色体联合的方式结合,联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,染色体在纺锤丝的牵引下向两极移动,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后45～50 min,卵子进行第二次卵裂,核相变化与第一次卵裂相同,在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂,最终形成3小1大4个卵裂球;受精后60～70 min,胚胎进行第三次卵裂,仍为不等全裂,但自此次卵裂起已开始进行螺旋分裂。此外,对实验中发现的缢蛏极少量多精入卵、多极分离等异常细胞学现象进行了分析,并探讨了海洋贝类卵子阻止多精入卵发生的机制。

文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用,研究通过已构建的文蛤转录组文库,利用SMART RACE技术扩增得到文蛤HDAC1(Mm-HDAC1)基因的c DNA全长序列,分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征,并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示,Mm-HDAC1基因的c DNA全长3065 bp,开放阅读框1599 bp,编码532个氨基酸;氨基酸序列比对发现,文蛤与其他物种同源性为74.3%—78.7%。荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明,Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达,其中外套膜中的表达量相对最高,并与其他组织间有极显著差异(P<0.01);不同发育时期的表达差异结果表明,MmHDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P<0.05)。SNP位点筛查结果表明,在MmHDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点,其中有3个SNP位点(627A>T、924T>C和1266T>C)与文蛤生长相关。

毛蚶受精和早期卵裂过程核行为的荧光显微镜观察

利用Hoechst33258染色、荧光显微镜观察方法,对毛蚶受精和早期卵裂过程中核行为的细胞学变化进行了详细观察.结果表明,毛蚶成熟未受精卵呈卵圆形,卵径为52.909±2.092μm,核相处于第一次成熟分裂中期.在水温为26±1℃条件下进行受精,在受精后15~18、20~25 min,受精卵先后排出第一、第二极体,完成第一次和第二次成熟分裂;受精后30 min左右,雌、雄性原核形成;受精后35 min,雌、雄性原核各自形成染色体组,在卵子中央发生联合,染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的卵裂球;受精后55~60 min,受精卵完成第二次卵裂,形成1大3小4个卵裂球.另外,在研究中还发现了极少量的多精受精、多极分离等异常细胞学现象,对其成因及机制进行了分析和探讨.