脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2、Bax、Bid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。[方法]用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·m L^(-1))对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。[结果]不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P<0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·m L^(-1)时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P<0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·m L^(-1)时极显著下降(P<0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·m L^(-1)时极显著下降(P<0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P<0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·m L^(-1)时极显著增加。[结论]DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对仔猪海马神经细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对仔猪海马神经细胞的凋亡及其信号通路的影响。[方法]体外培养仔猪海马神经细胞至对数生长期,以不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^(-1))进行处理,采用倒置显微镜和透射电镜观察细胞的形态学变化及线粒体结构,CCK-8试剂盒检测细胞的存活率,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化,ELISA试剂盒检测caspase-3酶活性,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Bcl-2和Bax mRNA的表达水平。[结果]DON可显著抑制仔猪海马神经细胞存活率并诱导细胞发生明显的形态学变化,且具有剂量和时间效应;DON可降低线粒体膜电位,增强caspase-3酶活力,并通过上调Bax mRNA和下调Bcl-2 mRNA的表达,增加Bax/Bcl-2值。[结论]DON可通过引起线粒体功能障碍,激活caspases-3并调节Bcl-2家族基因,从而诱导仔猪海马神经细胞凋亡。

AFB_1和DON对小鼠的联合毒性研究

旨在研究黄曲霉毒素B1(AFB1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对小鼠的单独及联合毒性作用。选取21日龄昆明系雄性小鼠96只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复8只。试验期间各组小鼠饲喂相同的饲料,第Ⅰ组为对照组,每天灌服生理盐水,第Ⅱ组灌服200μg·kg-1AFB1,第Ⅲ组灌服500μg·kg-1DON,第Ⅳ组灌服200μg·kg-1AFB1+500μg·kg-1DON。试验期为30 d。分别于试验的第15天和第30天,每个重复随机选择4只小鼠经眼球采血,用于测定血清生化指标,同时剖检小鼠,取肝脏和脾脏,计算脏器指数,并观察肝脏病理变化。结果显示,在试验第15天时,与对照组相比,第Ⅳ组小鼠肝脏、脾脏相对指数、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、丙二醛(MDA)含量显著升高,总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量显著降低;同时,第Ⅳ组小鼠肝脏、脾脏相对指数、AST活性和MDA含量显著高于第Ⅱ、Ⅲ两组。试验至30 d时,与对照组相比,第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠的增重量均显著降低;第Ⅳ组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和r-谷氨酰基转移酶(r-GT)活性显著升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性和TP、ALB含量显著降低;与第Ⅱ、Ⅲ组相比,第Ⅳ组小鼠血清ALP、r-GT活性和MDA含量显著升高,而SOD活性显著降低。试验表明,AFB1和DON可显著降低小鼠的增重量、肝脏与脾脏指数、改变血清生化指标,且两者联合毒性作用大于任一毒素的单独毒性。

DON暴露对雏鸡神经递质及钙调蛋白含量的影响

【目的】通过DON暴露体内试验,根据雏鸡脑组织中神经递质含量及钙调蛋白(CAM)含量的变化,研究DON对雏鸡的神经毒性作用。【方法】选取120只健康1日龄海兰蛋鸡(公)预饲1周后,按单因素试验设计随机均分为DON低、中、高剂量组和对照组,对照组和试验组饲喂相同的全价日粮。DON低剂量组、中剂量组和高剂量组分别按采食量中含DON 0.27,1.68和12.21mg/kg的剂量灌胃,对照组灌服等量的生理盐水。试验从第8天开始,每隔7d染毒1次,共染毒5次。试验期为36d。试验结束时,每组随机屠宰20只鸡,迅速取出脑组织,检测神经递质含量和CAM含量的变化。【结果】经高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)检测,雏鸡脑组织中未发现5-羟色胺吲哚乙酸(5-HIAA);与对照组相比,DON高剂量组雏鸡脑组织中去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)含量显著升高(P<0.05),而多巴胺(DA)含量显著降低(P<0.05)。与对照组相比,DON中、高剂量组雏鸡神经细胞内游离钙([Ca2+]i)浓度和脑组织中CAM含量显著降低(P<0.05),不同DON剂量组CAM mRNA基因相对表达量均显著降低(P<0.05)。【结论】DON暴露可引起雏鸡神经钙稳态变化,并影响部分神经递质的分泌,对雏鸡具有一定的神经毒性作用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PC12细胞自噬的影响

【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对PC12细胞自噬的影响。【方法】以不同质量浓度(0(CK),125,250,500,1 000和2 000ng/mL)的DON处理PC12细胞24h后,采用倒置显微镜、透射电镜、免疫荧光、荧光定量PCR、Western-blot等技术,研究DON对PC12细胞形态和超微结构、LC3聚点率及自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62 mRNA和蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K表达的影响。【结果】不同质量浓度的DON均可诱导PC12细胞自噬,各试验组细胞自噬水平均高于对照组(CK),并随着DON质量浓度的增大而先增加后下降,在DON质量浓度为1 000ng/mL时达到峰值。与对照组相比,各试验组classⅢPI3 K mRNA和Beclin-1mRNA表达水平均极显著增高(P<0.01),P62mRNA表达水平随着DON质量浓度的增加总体呈下降趋势,差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。Western-blot结果显示,LC3Ⅱ蛋白表达量在DON质量浓度为1 000ng/mL时最高,与对照组相比,250~2 000ng/mL DON处理组的LC3Ⅱ蛋白表达量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加;500~2 000ng/mL DON处理组classⅢPI3K蛋白表达量较对照组显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加,其中以1 000ng/mL DON处理组表达量最高;与对照组相比,不同质量浓度DON处理组P62蛋白表达量均极显著降低(P<0.01),其中以1 000ng/mL DON处理组最低。【结论】DON能够诱导PC12细胞发生自噬,自噬相关基因classⅢPI3 K、Beclin-1、P62及蛋白LC3Ⅱ、P62、classⅢPI3K等参与了DON诱导PC12细胞自噬的调控。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取、纯化及含量检测

本试验通过提取和纯化方法的优化,旨在获得高纯度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。首先将禾谷镰刀菌孢子液接种于玉米培养基,于27℃30%湿度的条件下培养25d,收集产毒培养基,制成毒素粗提液。经过层析柱2次洗脱,分段收集洗脱液,用薄层色谱法(TLC)确定含DON的洗脱液,合并洗脱液,运用多重结晶法进行纯化,获得DON的纯品,高效液相色谱法(HPLC)进行分析确认。采用该培养方法,每千克玉米培养基可产生DON 56.65 mg,纯化后可得到DON 29.5mg,纯度达到98.1%;HPLC检测条件为:Waters C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为乙腈-水(16∶84),流速0.8mL/min,紫外波长218nm,色谱柱柱温30℃;本方法加标回收率为86.9%~100.6%,日内相对标准偏差≤9.42%,日间相对标准偏差≤5.79%。本试验建立的DON提取与纯化方法简单,不需要任何特殊的试剂与设备,且该检测方法回收率高,准确度和精密度均能满足试验要求,为DON纯品的定量提供了技术支撑。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对仔猪海马神经细胞的毒性作用

为了研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对仔猪海马神经细胞的毒性作用,于体外培养仔猪海马神经细胞至对数生长期,以0、125、250、500、1 000和2 000 ng/m L不同质量浓度的DON对细胞进行染毒处理,应用倒置显微镜和透射电镜观察细胞的形态学变化;Hoechest 33258染色液对细胞核进行标记,观察细胞核的形态学变化;CCK-8试剂盒检测细胞的存活率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH漏出率。结果显示,与对照组相比,处理组细胞发生了明显的形态学变化,随着DON质量浓度增加,细胞密度降低、空泡化、染色质浓缩聚集、产生凋亡小体;处理组细胞的存活率明显降低,具有剂量和时间依赖性。LDH漏出率随着DON质量浓度的增加而增加,与对照组相比,当质量浓度达到500 ng/m L以上时,差异极显著(P<0.01)。试验表明,DON对仔猪海马神经细胞具有明显的毒性作用,能够诱导细胞损伤,发生凋亡。