软刺裸鲤和齐口裂鳆鱼HIF1B和HIF2A的克隆及低氧适应性的表达分析

获得高原软刺裸鲤(Gymnocypris dobula)和齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)HIF1B和HIF2A基因c DNA完整的开放阅读框(ORF),并进行氨基酸序列分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测了HIF1B和HIF2A在两种裂腹鱼体内各组织中的表达,以及应激性低氧条件下罗非鱼不同组织中的表达。基因序列分析结果显示,软刺裸鲤和齐口裂腹鱼HIF1B基因长度分别为2 322 bp和2 313 bp,预测编码773和770个氨基酸;HIF2A基因长度分别为2 466 bp和2 502 bp,预测编码821和833个氨基酸。同源分析显示,齐口裂腹鱼和软刺裸鲤HIF1B ODD结构域氨基酸序列同源性为93.12%,HIF2A为89.56%。在CODD保守结构域中,软刺裸鲤HIF1B的LxxLAP位点突变成Pxx LAP,这可能是高原裂腹鱼HIF1B功能进化的重要标志。定量检测结果表明,在应激性低氧环境中,硬骨鱼类鳃和皮肤中HIF1B和HIF2A mRNA的表达上升;而在长期低氧环境中,硬骨鱼类鳃和皮肤中HIF1B和HIF2A mRNA的表达下降,推测硬骨鱼体内可能存在两种不同的机制来适应长期低氧和应激性低氧环境。

南极冰鱼和伯氏肩孔南极鱼EPO基因预测及生物信息学分析

运用PCR、TA克隆及二代测序技术获得了独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)、伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)的EPO区域基因组DNA序列,并结合生物信息学方法进行了基因结构与保守功能域等生物学特性研究。结果表明:克隆获得的独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼EPO基因序列分别为2727 bp和2820 bp,包括5个外显子和4个内含子结构,编码区全长皆为558 bp,推定编码185个氨基酸。理化性质分析得到两者的EPO蛋白皆为相对稳定的酸性可溶性蛋白。其三级结构预测结果都显示出典型的4个反相平行的α螺旋结构特征,保持了其在生物体内发挥的原有作用。多重序列比对显示,独角雪冰鱼EPO与伯氏肩孔南极鱼的氨基酸同源性为95.2%,而与其它物种的同源性在53.9%—85.5%之间。系统发育树显示,独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼的EPO基因与鱼类的同源基因聚类,系统进化情况同亲缘关系一致,表明EPO基因在进化过程中具有较强保守性。本研究为揭示EPO基因在南极冰鱼内的遗传特性提供理论依据,并为进一步探讨EPO基因在极端低温高氧环境中的鱼类适应性进化研究奠定了基础。

COⅠ和16S rRNA基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用

针对裂腹鱼种类繁多、种间形态学差异不明显的特点,利用分子标记对高原裂腹鱼进行准确的物种鉴定具有重要价值。对采集的60尾高原裂腹鱼进行了COⅠ和16S rRNA基因的部分序列测定,并通过Gen Bank数据库进行鱼种鉴定;运用邻接法(NJ)构建系统发育树,对实验鱼进行群系划分;通过DNASP软件分析比较实验鱼COⅠ和16S rRNA基因的序列变异;依据MEGA 6.0的Kimura-2-parameter模型计算实验鱼的种内遗传距离和种间遗传距离,并对COⅠ和16S rRNA基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的适用性进行探讨。结果表明,采集的样本包含3属、5种裂腹鱼,分别为尖裸鲤属的尖裸鲤(Oxygymnocypris stewartii)、裸鲤属的软刺裸鲤(Gymnocypris dobula)、裂腹鱼属的拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)、巨须裂腹鱼(Schizothorax macropogon)和异齿裂腹鱼(Schizothorax oconnori)。在COⅠ基因构建的系统发育树中,5种高原裂腹鱼均形成独立的一支,而16S rRNA基因不能准确地对裂腹鱼属的3个鱼种实现区分。研究显示,5种高原裂腹鱼COⅠ基因核苷酸的变异水平(Pi)和单倍型多样性指数(Hd)均高于16S rRNA基因;COⅠ基因计算得到实验鱼种间遗传距离和种内遗传距离平均值分别为0.025和0.002,种内和种间的最大遗传差异约为13倍;16S rRNA基因得出结果为0.026和0.005,而种内和种间的最大遗传差异约为6倍。综合COⅠ和16S rRNA基因能有效鉴定高原裂腹鱼物种,而在单个基因的选择上,COⅠ基因具有更高的适用性。