代谢工程改造大肠杆菌从头合成1,4-丁二醇

1,4-丁二醇是一种重要的中间体,广泛应用于化工、农业、医药等领域。本研究将酶工程和代谢工程相结合,构建了一条以葡萄糖为底物生产1,4-丁二醇的新途径。首先,通过数据库挖掘设计了一条包含α-酮酸脱羧酶(α-ketoglutarate decarboxylase,SucA)、羧酸还原酶(carboxylate reductase,Car)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,YqhD)的新型催化途径,引入底盘细胞W3110(K-12)后,实现了1,4-丁二醇的从头合成。为进一步提高该路径的合成效率,敲除了乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase A,LdhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase B,PflB)基因,阻断旁路代谢途径;强化表达柠檬酸合酶(citrate synthase,GltA^(R163L)),增加α-酮戊二酸代谢通量;强化底盘细胞中关键辅酶NADPH合成量并替换强启动子强化sucA、car、yqhD基因表达量,改善了1,4-丁二醇合成前体的供给效率。最终,重组菌株摇瓶发酵48 h最高合成770 mg/L的1,4-丁二醇,在5 L发酵罐上发酵60 h,1,4-丁二醇产量达4.22 g/L,得率为12.46 mg/g葡萄糖。本研究设计了一条新的1,4-丁二醇从头合成路径,与已报道的路径相比,该路径无需乙酰辅酶A参与,避免了副产物乙酸的积累,同时避免了氨的添加,为代谢工程改造生产1,4-丁二醇及其高附加值衍生产品提供了一种新的思路。

多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)