海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参（Stichopusjaponicus）溶菌酶（SjLys）可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法，以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究，构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现，30℃、140r／min、IPTG浓度0．3mmol／L、诱导后继续培养14h，目的蛋白分泌表达量可达到30-40mg／L，且产物以大量可溶性蛋白存在。

产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化

从大连海域的海参肠道中筛选得到一株产碱性蛋白酶较高的海洋细菌HS-A156，经形态学和16SrDNA序列分析初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）（GenBank检索号KCl66863）。对菌株HS-A156的酶学性质进行初步研究，结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用pH为9．0，在pH8．O～11．0性能稳定；最适作用温度为40℃，在25～45℃具有良好的热稳定性。同时对该菌株产酶发酵培养基和发酵条件进行优化，确定了最适产酶培养基组成为葡萄糖1．5％、牛肉膏1．0％、酵母粉2．0％、CaCl20．05％；最佳发酵条件培养基初始pH8．0、发酵温度30℃、接种量3％。经过优化后菌株HS-A156产碱性蛋白酶的酶活力达到538U／mL，比优化前的产酶量提高了3．7倍。

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。