芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠肝脏细胞自噬的影响

目的观察芪术颗粒对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型自噬的影响。方法将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、复方鳖甲软肝片组、芪术颗粒组,除正常对照组外其余各组均腹腔注射CCl4建立肝纤维化模型,按照组别对应处理。4周后取肝组织,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及自噬相关基因3(autophagy-related gene 3,Atg3)、自噬相关基因Beclin1介导的蛋白表达,Real-time PCR检测Atg3、Beclin1基因表达,电镜下观察自噬情况。结果与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝α-SMA蛋白显著增多(P<0.01);与模型对照组比较,复方鳖甲软肝片组、芪术颗粒组肝α-SMA蛋白显著减少(P<0.05);与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝Atg3蛋白表达显著增加(P<0.01),Atg3基因表达增加,Beclin1蛋白及基因表达增加,自噬溶酶体和自噬体数量增多;与模型对照组比较,芪术颗粒组、复方鳖甲软肝片组Atg3蛋白及基因表达降低(P<0.05),芪术颗粒组Beclin1蛋白及基因表达降低(P<0.05),芪术颗粒组、复方鳖甲软肝片组组织中自噬溶酶体、自噬体数量减少。结论芪术颗粒可通过抑制肝脏细胞Atg3、Beclin1表达而影响自噬从而发挥其抗肝纤维化作用。

芪术颗粒对肝窦内皮细胞的影响及机制研究

目的 探讨芪术颗粒含药血清对四氯化碳(CCl)诱导的肝纤维化模型大鼠肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)失窗孔化及整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)-大鼠肉瘤(rat sarcoma,Ras)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路的影响与机制。方法 70只雄性Wistar大鼠,先取50只大鼠分为正常对照组、模型组及芪术颗粒高、中、低剂量组,每组10只,分别给予相应处理,制备含药血清和正常对照组血清。另20只雄性Wistar大鼠用于制备肝窦内皮细胞,其中14只大鼠采用CCl腹腔注射建立肝纤维化模型4周后,采用Masson与HE染色观察肝纤维化程度。另6只大鼠作为正常对照。分离LSECs,将LSECs分为阳性对照组、模型组、芪术低剂量组、芪术中剂量组、芪术高剂量组,其中模型组加入正常大鼠血清,其余组分别加入相应含药血清,常规培养48小时,进行相关指标检测。流式细胞仪检测大鼠肝窦内皮细胞中的血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)阳性细胞比例和肝窦内皮细胞1抗体(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE-1)阳性细胞比例;扫描电镜观察肝窦内皮细胞窗口情况;Western Blot法检测LSECs中CD31、SE-1、Ras、ITGαVβ3、FAK、MAPK、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylation focal adhesion kinase,p-FAK)及磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylation mitogen-activated protein kinases,p-MAPK)蛋白表达情况。结果 (1)大鼠CCl腹腔注射造模后纤维增生显著,肝纤维化LSECs组的CD31阳性细胞比例和SE-1阳性细胞比例均显著升高。(2)模型组窗孔数少而稀疏,芪术颗粒干预后,扫描电镜观察LSECs窗孔数有所恢复,尤以芪术高剂量组明显。(3)与模型组比较,芪术各剂量组的SE-1、CD31、αVβ3表达量明显降低(P<0.05),其中芪术各剂量组的SE-1、CD31、αVβ3表达量随剂量的升高而降低,表现为一定的剂量依赖关系。与正常对照组相比,模型组LSECs中整合素αⅤβ3、p-FAK和p-MAPK蛋白的表达增加(P<0.05)。(4)经芪术颗粒含药血清治疗后,CCl诱导的肝纤维化大鼠LSECs整合素αⅤβ3、FAK、MAPK、p-FAK和p-MAPK蛋白表达降低(P<0.05)。结论 芪术颗粒含药血清可通过减轻CCl诱导的肝纤维化大鼠LSECc失窗孔化、改变LSECs表型,减少毛细血管的增值,从而发挥抗肝纤维化的作用,其机制可能与调控整合素αVβ 3-FAK-Ras/MAPK信号通路有关。