气肿疽梭菌CctA基因的真核表达

为了控制延边地区气肿疽病的发病率,制备出有效的核酸疫苗,根据NCBI上气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)的基因序列设计出一对特异性引物。将PCR扩增的CctA基因克隆到pMD19-Tsimple载体,对测序正确的基因进行序列分析,再次克隆至pcDNA3.1-1真核表达载体,并且将其转染Vero细胞。结果表明,pcDNA3.1-CctA组通过转染后的细胞存在绿色荧光的现象,同时pcDNA3.1-CctA重组质粒表达的产物大小约19ku,说明Vero细胞中的pcDNA3.1-CctA质粒成功表达了CctA蛋白。

气肿疽梭菌多克隆抗体的制备及Dot-ELISA检测方法的建立

为建立快速有效的气肿疽检测方法,制备气肿疽梭菌多克隆抗体。以斑点酶联免疫吸附方法,筛选出最佳工作条件,确定抗体最佳稀释度为1∶1 024;可检测到最低菌体抗原量为3.125μg,最低分泌抗原量为1.89μg;最适酶标二抗浓度为1∶4 000。应用该方法检测20份死于气肿疽的豚鼠脏器,其中肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肌肉阳性率分别为95%、95%、90%、90%、85%和90%;与琼脂免疫扩散试验(AGID)法相比,灵敏度是其40倍。该试验成功建立了检测气肿疽病原体的Dot-ELISA方法。

气肿疽梭菌NanA基因克隆及生物信息学分析

为了对气肿疽梭菌NanA基因进行克隆及生物信息学分析,试验根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列设计并合成1对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD18-T载体中,对测序正确的NanA基因进行序列对比分析,对NanA蛋白进行理化性质分析与二级结构预测,同时使用在线软件预测NanA蛋白三级结构。结果表明:成功扩增出气肿疽梭菌Nan A基因,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸序列和氨基酸序列与NCBI公布的JF4135 NanA基因序列的同源性均为99.8%。NanA蛋白分子质量约为71 ku,具有较高的抗原指数,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,有多个抗原表位区域。

气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

为构建气肿疽NanA基因真核表达质粒,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了1对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,将连接后的pMD 18-T-NanA进行鉴定分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达质粒连接。结果表明:构建的重组克隆质粒pMD 18-T-NanA和重组表达质粒pVAX1-NanA经PCR鉴定和酶切鉴定正确。该试验成功构建了气肿疽NanA基因真核表达质粒,为气肿疽核酸疫苗的制备奠定了基础。

延边地区牛气肿疽的流行病学调查

本研究旨在了解吉林省延边地区气肿疽的流行情况,分别采用血涂片染色镜检法和PCR方法对延边地区4个县市的165头份牛的血液样本进行了检测,并对不同地区、不同饲养方式、不同品种、不同年龄、不同地理条件等采集的样本进行了比较。结果显示,PCR方法检测牛气肿疽的平均阳性率为15.2%(25/165),显著高于血涂片染色镜检法检测的阳性率8.5%(14/165)。统计学分析表明,牛气肿疽感染率在不同地区、不同品种之间差异性不显著(P>0.05);而不同年龄、不同地理条件气肿疽感染率差异性显著(P<0.05);在个体农户饲养方式中的阳性率显著高于规模化养殖方式(P<0.01),说明牛感染气肿疽受年龄、地理条件、饲养方式等因素的影响较大。本试验表明吉林省延边地区是牛气肿疽的流行地区,为当地的牛气肿疽的防控提供了理论依据。