qPCR检测白纹伊蚊携带Wolbachia分型及密度方法的建立与应用

目的白纹伊蚊天然携带A与B亚组沃尔巴克氏体Wolbachia,这种共生菌能够通过抑制宿主传播病毒能力或降低宿主种群密度来控制虫媒疾病传播,且这种作用强度与其密度密切相关,本文旨在建立一种准确检测蚊虫携带Wolbachia分型与密度的方法。方法克隆白纹伊蚊携带Wolbachia的wsp基因并测序,在w AlbA与w AlbB wsp基因的非保守区设计特异性引物,建立qPCR检测方法。结果该方法灵敏性和特异性良好,两亚组Wolbachia无交叉反应。利用该方法检测不同浓度四环素处理后蚊虫携带Wolbachia密度下降程度,确定最适四环素处理浓度为0.1 mg/mL。结论本方法的建立为研究Wolbachia在蚊虫生理生殖和天然免疫方面的作用提供了技术支撑。

四环素降低致倦库蚊共生Wolbachia密度方法的建立及效果评价

胞内共生菌Wolbachia在昆虫生理生殖和天然免疫方面发挥着重要作用,蚊虫体内的Wolbachia密度与其抗病毒作用有很强的相关关系。本研究建立了一种利用四环素处理幼虫降低致倦库蚊共生Wolbachia密度的方法,并采用实时荧光定量PCR进行了效果评估。结果显示,使用0.05 mg/mL四环素处理致倦库蚊海口株和温州株,处理后Wolbachia密度中位数分别下降2729和3507倍;卵巢及其余组织的Wolbachia密度均下降至0.001以下,其中,卵巢中Wolbachia密度下降825629倍。可见,0.05 mg/mL四环素处理幼虫能显著降低蚊虫体内Wolbachia密度,为后续清除Wolbachia、探究Wolbachia对致倦库蚊感染和传播病毒的影响提供了技术基础。

感染寨卡病毒后埃及伊蚊黄病毒NIRVS表达的检测

本研究通过高通量测序技术检测了寨卡病毒(ZIKV)感染组、血餐对照组和糖水对照组埃及伊蚊中肠组织小RNA的丰度,并筛选出差异表达的6个黄病毒NIRVS和9个棒状病毒NIRVS。针对筛选出的6个NIRVS设计引物用两步法逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)方法验证了ZIKV感染第4、7和10天中肠组织中黄病毒NIRVS片段的表达。结果显示,黄病毒NIRVS AeFlavi53在感染第4、7天均上调,结果与小RNA测序一致,AeFlavi34B和AeFlavi4A在感染第4天上调,第10天下调,但在第7天表达无变化,与小RNA测序结果不一致,其余片段表达量在感染组与对照组间无统计学差异。RT-qPCR与高通量测序的结果一致性差,其原因可能是因为细胞中长链piRNA前体受上游转录和下游酶切多个程序的调节,针对其设计引物进行定量检测的结果不稳定。

可调控肝脏特异性表达HCV全基因转基因小鼠模型的建立

目的:构建一种可调控肝细胞特异性表达丙型肝炎病毒(HCV)全基因的小动物模型。方法:将9.6 kb的HCV全长基因JFH1插入Tet-on系统效应表达载体p TRE2中,并在HCV全基因3'端插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列,从而构建转基因载体p TRE2-JFH1(HCV);将该转基因载体线性化后显微注射获得整合有HCV全基因的TRE2-HCV首建鼠;将该阳性鼠与本室保存的Alb-rt TA转基因小鼠杂交,获得肝细胞白蛋白启动子调控HCV全基因表达的Tet-on-Alb-HCV双转基因小鼠;在强力霉素(Dox)诱导后通过PCR、Western印迹、免疫组化等方法鉴定转基因小鼠HCV基因整合及HCV蛋白在肝组织中的表达;实时定量PCR检测小鼠血清及肝组织中的HCV滴度;用HCV反义小分子药物anti-mi R122评价该模型在药物评价中的应用。结果:获得了整合rt TA基因和HCV全长基因的双转基因小鼠;Dox诱导下,该转基因小鼠可在肝组织长期特异性表达HCV全长基因,小鼠血清中可检测到HCV的RNA;分子药物anti-mi R122可降低血清中的HCV滴度。结论:构建了可调控肝组织特异性表达HCV全基因的转基因小鼠模型,该小鼠模型可应用于HCV药物筛选和评价研究。

哺乳动物细胞与蚊虫细胞交替传代培养模型用于乙脑病毒基因变异规律的研究

为模拟乙脑病毒在哺乳动物和蚊虫宿主体内交替传代的自然感染过程,以哺乳动物细胞与蚊虫细胞为培养载体,交替传代培养乙脑病毒SA14毒株,之后对传代培养获得的部分毒株进行序列测定、分析,藉此研究宿主选择压力下乙脑病毒基因变异规律。结果显示,乙脑病毒基因序列变异位点较多,但是突变类型均以单个碱基点突变的形式出现,未发生插入或缺失突变,提示自然传播条件下乙脑病毒进化比较保守。研究结果与既往有关乙脑病毒基因变异及生存适合度研究报道相近,表明此实验模型适应于乙脑病毒乃至其他虫媒病毒基因变异研究。

不同气候区白纹伊蚊滞育卵差异研究

白纹伊蚊Aedes albopictus是登革病毒、寨卡病毒等多种病原体的重要传播媒介,广泛分布于我国温带和亚热带地区,以滞育卵越冬。一旦虫媒病毒扩散到我国北亚热带地区,非流行季节时期病毒的保存方式,将成为虫媒病毒研究中的重要问题。本研究开展了白纹伊蚊滞育卵的生态学研究,发现在短光照下不同地理株白纹伊蚊滞育卵的滞育率从产卵后7 d逐渐上升到21 d,至40 d趋于平缓并达到最高,滞育率在滞育前期和滞育后期统计学上差异显著。在滞育中后期,北京株白纹伊蚊滞育率相比杭州株白纹伊蚊和广州株白纹伊蚊滞育率明显较高。卵孵化后,不同地理株白纹伊蚊的卵的孵化率在滞育前期和滞育后期有显著差异。在短光照下滞育后期北京株白纹伊蚊的卵孵化率(21.45%)明显比广州株白纹伊蚊的卵孵化率(8.15%)高,提示位于温带地区的北京株白纹伊蚊较位于亚热带地区的杭州株和广州株白纹伊蚊滞育率和孵化率更高,说明位于温带地区的白纹伊蚊品系的滞育卵更能在冬季不良环境如低温等下存活,有利于增加越冬存活率。通过白纹伊蚊以滞育卵实现种群扩散、定殖的重要生物学基础,为探索新型蚊媒的控制途径提供科学依据。

基于白纹伊蚊Actin基因参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种以白纹伊蚊Actin基因表达量作为参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测技术,为登革病毒在蚊虫中的定量检测提供更准确的检测方法。根据登革Ⅱ型病毒和白纹伊蚊Actin基因保守区序列设计引物和探针,在检测体系中同时加入病毒和Actin基因的特异性引物,计算每个样本中病毒含量与Actin表达量的比值,得到更为准确的定量结果。该方法重复性好、灵敏度高,可用于实验室白纹伊蚊感染登革Ⅱ型病毒的病毒载量检测。

登革病毒在人与蚊虫细胞正选择压力下的致病性与基因序列变化分析

自然界中登革病毒在蚊虫与哺乳动物宿主内交替循环复制,研究病毒与不同类型宿主细胞间的相互作用有助于理解病毒基因突变与毒力变化的关系。本研究将登革2型病毒在人肝癌细胞(Huh-7)和蚊虫细胞(C6/36)之间交替传代模拟登革病毒在自然界中的人类与蚊虫间的交替感染,通过检测第10、18代病毒对小鼠的毒力以及在蚊虫中的感染率、传播率来评价病毒的适应性,同时对病毒基因组进行了测序。结果显示,登革2型病毒经交替传代后适应性降低,单种细胞中连续传代后适应性增高。序列分析显示病毒在C6/36细胞中连续传代后积累的突变数少于在Huh-7细胞中连续传代或两种细胞中交替传代积累的突变。另外,连续传代过程中出现的E蛋白155和186位点的氨基酸突变可能与毒力增强有关,交替传代过程中出现的E蛋白307位点氨基酸突变可能与毒力减弱有关。结果揭示了登革病毒毒力变化与基因突变的关系,有助于监测病毒毒力变化,预测疾病的流行。

低温和短日照诱导白纹伊蚊滞育的代谢适应研究

目的检测白纹伊蚊滞育期间成蚊及卵内总糖、糖原、总胆固醇、甘油三酯、山梨醇、海藻糖指标含量的变化,为白纹伊蚊的滞育生理学研究提供理论基础。方法在实验室条件下,通过设置短日照和低温诱导白纹伊蚊滞育,取产卵后雌蚊及滞育维持期蚊卵,对总糖、糖原、海藻糖、甘油三酯、总胆固醇、山梨醇等生化物质进行提取,通过酶标仪检测其含量。运用GraphPad 8.0软件对实验数据进行非配对t检验统计分析。结果在滞育诱导条件下,白纹伊蚊成蚊总糖、糖原、海藻糖、山梨醇、甘油三酯、总胆固醇含量分别为(21.60±2.21)、(28.23±0.16)、(6.89±0.28)、(21.71±3.89)、(52.54±4.98)mg/g和(19.08±1.68)μmol/g,总糖、糖原、山梨醇较正常发育组高(均P<0.05)。蚊卵内总糖、糖原、海藻糖、总胆固醇生化指标含量分别为(103.94±8.06)、(8.61±1.54)、(1.35±0.07)mg/g和(13.58±0.28)μmol/g,均高于正常发育组(均P<0.01)。结论白纹伊蚊在滞育诱导条件下,卵内及成蚊体内生化指标发生不同程度的升高。总糖、糖原、海藻糖、总胆固醇等生化指标在蚊虫滞育生理中的作用在接下来的实验中可以进一步研究。