刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建

为构建刚地弓形虫SRS29C基因原核表达质粒,利用SignalP-5.0软件预测信号肽序列,去除SRS29C前端信号肽序列,设计引物并扩增SRS29C截短型基因序列,克隆并构建原核表达质粒。结果显示:SRS29C基因前51位氨基酸为信号肽区域,故将此段信号肽序列切除,获得长度为966bp的SRS29C截短型基因片段(SRS29Ccut),成功构建原核表达质粒p ET-28a-SRS29Ccut和p ET-32a-SRS29Ccut。此研究为今后对刚地弓形虫SRS29C蛋白的生物学功能及免疫特性进行更深入研究打下基础。

弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定

为了探究刚地弓形虫SRS29C基因的生物学特性,利用大肠杆菌原核表达系统将SRS29C基因进行体外表达并制备多克隆抗体。同时利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫SRS29C基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶筛选及PCR单克隆筛选,并进行Western blot试验进一步验证SRS29C单克隆敲除株。结果显示,SRS29C蛋白在体外成功表达,且制备的多克隆抗体免疫原性良好。SRS29C基因敲除株在加入乙胺嘧啶后能够正常生长,经PCR鉴定能扩增出797 bp的5′UTR(SRS29C)片段及576 bp的3′UTR(SRS29C)片段,且未扩增出SRS29C基因片段,而在对照组中扩增出了700 bp的SRS29C片段,同时蛋白验证基因敲除株中未能表达SRS29C蛋白。结果表明,成功构建并筛选出SRS29C基因敲除单克隆虫株,暂时命名为ME49△SRS29C及RH△SRS29C,为弓形虫SRS29C基因功能的研究奠定了基础。

基于pgk蛋白的犬嗜血支原体ELISA诊断方法的建立

为了开发一种准确、快速的检测犬嗜血支原体的方法,建立了一种基于犬嗜血支原体磷酸甘油酸激酶(PGK)的间接ELISA方法.从已发表的NCBI犬嗜血支原体全基因组序列库中获得了其磷酸甘油酸激酶(PGK)基因序列.通过选择原核生物首选的密码子优化基因序列,将化学合成的新基因序列pgk插入质粒中,成功构建了原核表达载体pet32a(+)-pgk,并在大肠杆菌BL21中表达.经SDS-PAGE证实,该蛋白的相对分子量约为60 ku.以纯化的PGK重组蛋白作为抗原进行包被,建立了基于PGK蛋白的间接ELISA方法,并进一步对条件进行优化.结果表明,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1∶200,封闭剂的最佳工作浓度为5%脱脂乳,最佳封闭时间为45 min,待检血清的最佳作用时间为60 min,酶标二抗的最佳工作浓度为1∶5000,酶标二抗的最佳作用时间为30 min.基于以上,建立了一种检测犬嗜血支原体的间接ELISA方法,并选择临床阴性血清计算其临界值.采用该方法检测166份临床样本,阳性率为21.1%,与荧光定量PCR检测结果一致.本研究为犬嗜血支原体的临床监测提供了一种有效的检测方法,并为进一步预防和治疗该病提供了研究依据.

刚地弓形虫CST1/BSR4免疫磁珠的制备及初步应用

通过在大肠杆菌原核表达系统中表达弓形虫包囊囊壁蛋白CST1以及缓殖子期表面蛋白BSR4,获得CST1及BSR4的重组蛋白,将此两种蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆抗体.之后将此两种多克隆抗体分别偶联磁珠,制备成免疫磁珠,此两种免疫磁珠可以识别弓形虫包囊及包囊中的缓殖子.将猪肉样品进行研磨或匀浆后与免疫磁珠进行反应,则样品液中的包囊或包囊中释放的缓殖子会特异性的与免疫磁珠结合,若加大样品量,则起到富集包囊或缓殖子的作用.将富集得到的成分进行后续的PCR检测,检测的目的基因为高拷贝的弓形虫529 bp片段,从而建立猪肉中刚地弓形虫免疫磁珠富集_PCR检测技术.通过PCR鉴定,结果表明制备的CST1、BSR4免疫磁珠能够有效的对猪肉中的弓形虫包囊以及缓殖子进行富集.