微小RNA-618通过靶向羧基末端结合蛋白2抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的探讨微小RNA(miR)-618及羧基末端结合蛋白2(CtBP2)对胰腺癌增殖、侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测胰腺癌细胞中miR-618的表达;分别转染miR-618 inhibitor和mimics后,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、克隆集落形成及Transwell实验检测miR-618对胰腺癌MIA PaCa-2和SW1990细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;运用在线数据库预测能够与miR-618结合的靶基因;RT-qPCR检测转染miR-618 inhibitor和mimics后相关靶基因的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-618 inhibitor组和mimics组中CtBP2的表达量;双荧光素酶报告基因实验检测miR-618和CtBP2的靶向结合情况;CCK-8、克隆形成和Transwell实验检测同时转染si-CtBP2和miR-618 inhibitor较单独转染si-CtBP2后对胰腺癌增殖及侵袭迁移的影响。组间比较采用t检验,组内两两比较采用LSD-t检验。结果BxPC-3(0.65±0.01)、MIA PaCa-2(0.45±0.07)、PANC-1(0.51±0.04)和SW1990(0.53±0.01)中miR-618的表达量低于正常胰腺导管上皮细胞(HPDE)(1.01±0.13,t=4.371、8.859、6.794、6.171,P<0.01),差异有统计学意义;干扰miR-618的表达后可显著促进胰腺癌MIA PaCa-2和SW1990的增殖、侵袭及迁移能力;同时在线数据库预测miR-618的潜在靶基因,结合RT-qPCR验证转染mimics和inhibitor后各候选基因的表达,结果提示仅有CtBP2与miR-618的表达呈负相关;进一步Western blot结果显示,转染miR-618 mimics后MIA PaCa-2(0.32±0.06)和SW1990(0.45±0.03)中CtBP2的表达量低于对照组(1.02±0.05和0.99±0.05,t=9.850、10.087,P<0.01),差异有统计学意义;双荧光素酶报告结果显示miR-618与CtBP2靶向结合(t=6.573,P<0.05),差异有统计学意义;功能回复实验结果显示共转染miR-618 inhibitor及si-CtBP2组可逆转单独干扰CtBP2后对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用。结论miR-618靶向CtBP2抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移。

miR-153-5p通过靶向FZD3基因抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:研究微RNA(microRNA,miR)-153-5p对胰腺导管腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测miR-153-5p在9例胰腺导管腺癌及相应的癌旁组织中的表达水平,以及其在胰腺正常导管上皮细胞HPDE和胰腺癌各个细胞系PANC-1、MIAPaCa-2、SW1990及BxPC-3中的表达水平,从中筛出PANC-1和SW1990细胞用于后续实验。采用脂质体法将miR-153-5p-模拟物(mimics)转入PANC-1及SW1990细胞使miR-153-5p过表达,以转入阴性对照(negative control,NC)-mimics作为阴性对照组。采用CCK-8法及Transwell小室实验检测miR-153-5p过表达对PANC-1及SW1990细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过Targetscan等多种在线预测软件及生物信息学分析miR-153-5p可能的靶基因,并采用实时荧光定量PCR法检测腺导管腺癌及相应的癌旁组织中卷曲蛋白家族受体3(Frizzled3,FZD3)mRNA的表达水平。采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测miR-153-5p过表达对FZD3 mRNA和蛋白表达水平的影响,并进一步利用双荧光素酶报告实验验证FZD3基因是否为miR-153-5p的靶基因。通过脂质体法将miR-153-5p-mimics以及携带有FZD3全基因的重组质粒共转入PANC-1和SW1990细胞,再用实时荧光定量PCR法及蛋白质印迹法检测FZD3 mRNA及蛋白的表达水平,并通过CCK-8法以及Transwell小室实验检测miR-153-5p和FZD3表达水平的变化对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:相较于正常胰腺组织或细胞,miR-153-5p在胰腺癌组织及各个细胞中的表达量明显更低(P均<0.05)。CCK-8和平板克隆实验显示,过表达miR-153-5p后对PANC-1和SW1990细胞的增殖能力被明显抑制(P均<0.05);划痕愈合实验结果显示,miR-153-5p过表达能够有效地延缓划痕伤口的愈合,抑制胰腺癌细胞的横向迁移能力(P均<0.05);Transwell小室实验提示,miR-153-5p过表达能明显抑制胰腺癌细胞侵袭和纵向迁移能力(P均<0.05)。利用在线预测软件及生物信息学分析得到FZD3基因可能是miR-153-5p的下游靶点;相较于正常胰腺组织,FZD3 mRNA在胰腺癌组织中的表达量明显升高(P<0.01),FZD3 mRNA与miR-153-5p的表达呈负相关(r=-0.5515,P=0.0219)。与阴性对照组相比,过表达miR-153-5p后PANC-1和SW1990细胞中FZD3 mRNA和蛋白的表达量明显减少(P均<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,miR-153-5p与FZD3 mRNA的3’-非翻译区(untranslated region,UTR)结合,下调FZD3蛋白的表达水平。当共转染miR-153-5p-mimics及携带有全基因的FZD3重组质粒后,过表达FZD3能够减弱miR-153-5p对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P均<0.05)。结论:miR-153-5p通过靶向FZD3基因抑制胰腺癌的侵袭和迁移,提示miR-153-5p可能是胰腺癌治疗中一种潜在生物标志物。