N^(6)-甲基腺苷修饰及其调控蛋白在脑缺血中的表达变化及意义

目的本研究通过探讨N^(6)-甲基腺苷(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)修饰及其调控蛋白在脑缺血小鼠中的表达变化,为脑缺血治疗的分子靶点研究提供参考。方法取60只雄性C57BL/6J小鼠,随机分为假手术组、脑缺血1 d组、脑缺血3 d组和脑缺血7 d组,每组各15只,采用线栓法制作右侧大脑中动脉梗死模型,于缺血1 h进行拔栓再灌注。通过RNA提取及斑点印迹实验检测小鼠缺血侧脑组织RNA m^(6)A水平;使用荧光定量逆转录PCR检测小鼠缺血侧脑组织甲基转移酶3(methyltransferase 3,Mettl3)、甲基转移酶14(methyltransferase 14,Mettl14)、FTOα-酮戊二酸酯依赖性双加氧酶(FTO alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase,Fto)、RNA去甲基化酶alkB同源基因5(alkB homolog 5,RNA demethylase;Alkbh5)、YTH N^(6)-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTH N^(6)-methyladenosine RNA binding protein 1,Ythdf1)、Ythdf2和Ythdf3的mRNA表达水平;利用免疫印迹实验检测缺血侧脑组织Mettl3、Mettl14、Fto、Alkbh5、Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3蛋白的表达水平;借助免疫荧光染色观察缺血侧脑组织梗死周边区神经元中Mettl3、Fto、Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3蛋白的表达变化情况。结果与假手术组相比,脑缺血3 d组脑组织RNA的m^(6)A水平升高(1.620±0.339 vs.1.000±0.192,P=0.0343)。(1)甲基转移酶表达情况:脑缺血7 d组Mettl3mRNA水平降低(0.675±0.059 vs.1.000±0.131,P=0.0331);脑缺血1 d组Mettl3(0.548±0.107 vs.1.000±0.056,P=0.0398)、Mettl14(0.534±0.218 vs.1.000±0.018,P=0.0108)蛋白表达水平降低;脑缺血3 d组Mettl3(0.410±0.341 vs.1.000±0.056,P=0.0084)、Mettl14(0.429±0.283 vs.1.000±0.018,P=0.0026)蛋白表达水平也均下降;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中Mettl3蛋白表达减少。(2)去甲基化酶表达情况:脑缺血1 d组(0.405±0.209 vs.1.000±0.142,P=0.0108)、脑缺血3 d组(0.530±0.125 vs.1.000±0.142,P=0.0412)Fto蛋白表达水平降低;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中Fto表达减少。(3)m^(6)A结合蛋白表达情况:脑缺血1 d组Ythdf1mRNA水平降低(0.708±0.046 vs.1.000±0.117,P=0.0331),Ythdf3mRNA水平升高(1.473±0.093 vs.1.000±0.142,P=0.0012);脑缺血3 d组Ythdf1(0.593±0.240 vs.1.000±0.117,P=0.0034)、Ythdf2(0.664±0.177 vs.1.000±0.200,P=0.0100)mRNA水平降低,Ythdf3 mRNA水平升高(1.451±0.281 vs.1.000±0.142,P=0.0018);脑缺血1 d组Ythdf1(0.486±0.177 vs.1.000±0.091,P=0.0197)、Ythdf3(0.536±0.107 vs.1.000±0.125,P=0.0400)蛋白表达水平降低;脑缺血3 d组Ythdf1(0.404±0.299 vs.1.000±0.091,P=0.0079)、Ythdf2(0.279±0.189 vs.1.000±0.261,P=0.0136)、Ythdf3(0.450±0.220 vs.1.000±0.125,P=0.0157)蛋白表达水平均降低;免疫荧光染色显示脑缺血3 d组梗死周边区神经元中m6A结合蛋白Ythdf1、Ythdf2、Ythdf3表达均减少。结论小鼠脑缺血后可能由Fto表达下调导致m^(6)A水平升高,Ythdf1、Ythdf2、Ythdf3蛋白表达水平趋势基本一致,可能存在功能冗余。

毛柳苷在脑缺血再灌注后抑制神经元自噬及神经保护作用研究

目的通过动物模型和体外细胞培养探索毛柳苷(salidroside,SAL)对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其可能机制。方法36只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(12只)、溶剂组(12只)和SAL组(12只)。线栓法制作小鼠右侧大脑中动脉闭塞模型,缺血1 h后再灌注,而后即刻尾静脉注射150μL SAL(剂量10 mg/kg,每只实际用量0.22 mg),溶剂组注射同等体积磷酸盐缓冲液,假手术组不给药。缺血再灌注后24 h进行小鼠神经功能缺损评分,神经元特异核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)染色统计脑梗死率。取溶剂组小鼠全脑冰冻切片,自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)分别与NeuN、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光共染,观察LC3B与梗死周边区神经元、星形胶质细胞共定位情况,以明确缺血再灌注后24 h产生自噬活动的主要部位。自噬标记物苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关蛋白3(autophagy related protein 3,Atg3)分别与NeuN免疫荧光共染,进一步观察梗死周边区神经元自噬水平变化情况,并统计Beclin-1^(+)/NeuN^(+)、Atg3^(+)/NeuN^(+)细胞在单位面积(1 mm^(2))内的个数。原代大鼠神经元培养10 d后进行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD),将细胞分为以下6组:对照(control,CON)组、OGD 1 h后复氧1 h(OGD 1 h)组、OGD 1 h后复氧4 h(OGD 4 h)组、SAL组、OGD 1 h后复氧1 h/全程SAL治疗(OGD^(+)SAL 1 h)组、OGD 1 h后复氧4 h/全程SAL治疗(OGD^(+)SAL 4 h)组,CON组和SAL组不进行OGD,SAL剂量50μmol/L。采用免疫印迹法检测各组细胞中自噬标记物LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5和Atg7的相对表达量;CON组、OGD 4 h组细胞进行LC3B、NeuN免疫荧光共染,观察OGD后神经元内LC3B表达变化情况,并统计LC3B^(+)/NeuN^(+)细胞在单位面积(1 mm^(2))内的个数。结果缺血再灌注后24 h,SAL组小鼠神经功能缺损评分(5.8±1.4分vs.7.1±1.4分,P=0.0332)和脑梗死率(28.7%±9.7%vs.39.9%±9.4%,P=0.0038)均低于溶剂组。溶剂组LC3B与梗死周边区神经元有共定位,与星形胶质细胞无共定位。SAL组Beclin-1^(+)/NeuN^(+)(312.4±45.6个/平方毫米vs.471.2±50.3个/平方毫米,P=0.0121)、Atg3^(+)/NeuN^(+)(322.5±26.5个/平方毫米vs.491.3±42.1个/平方毫米,P=0.0013)细胞数量少于溶剂组。大鼠原代神经元免疫印迹结果显示,OGD 1 h组(1.096±0.004 vs.1.000±0.000,P=0.0174)、OGD 4 h组(1.213±0.019 vs.1.000±0.000,P<0.0001)LC3B相对表达量高于CON组;OGD^(+)SAL 4 h组LC3B、Beclin-1、Atg3相对表达量低于OGD 4 h组(0.833±0.029 vs.1.213±0.019,P<0.0001,0.579±0.081 vs.1.152±0.144,P<0.0001,0.726±0.182 vs.1.091±0.177,P=0.0211);OGD^(+)SAL 4 h组LC3B、Beclin-1相对表达量低于OGD^(+)SAL 1 h组(0.833±0.029 vs.1.046±0.063,P<0.0001;0.579±0.081 vs.0.921±0.09,P=0.0030)。CON组LC3B^(+)/NeuN^(+)细胞数少于OGD 4 h组(51.9±18.7个/平方毫米vs.584.2±34.5个/平方毫米,P=0.0002)。结论SAL可能通过抑制神经元自噬在急性脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。

阿司匹林和氯吡格雷联合应用对小鼠脑缺血损伤后骨髓及脑内炎症反应的影响

目的探讨小鼠脑缺血损伤后阿司匹林和氯吡格雷联合应用21 d对骨髓中性粒细胞炎症因子及脑内小胶质细胞极化的影响。方法雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、阿司匹林联合氯吡格雷组(双抗组)2组,每组10只。通过结扎大脑中动脉远端制作脑缺血再灌注模型(缺血60 min,解开结扎实现再灌注),再灌注即刻通过灌胃给予饮用水100μL(对照组)和阿司匹林(剂量12 mg/kg,每只实际用量0.3 mg)与氯吡格雷(剂量12 mg/kg,每只实际用量0.3 mg)混悬液100μL(双抗组),每日1次,连续21 d。21 d后处死小鼠,分离骨髓中性粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测骨髓中性粒细胞相关炎症因子,包括IL-1β、IL-6、IL-10、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase,iNOS)、TNFα、精氨酸酶1(arginase1,Arg1)、转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)、CD206、CD32、几丁质酶样蛋白(chitinase-like 3,Chil3/YM1)的表达情况。脑组织行冰冻切片,免疫荧光染色标记离子化钙结合适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)、CD16和CD206,观察小胶质细胞数量、形态变化与极化状态。结果与对照组相比,治疗21 d后双抗组小鼠骨髓中性粒细胞IL-1β的相对表达下降(0.703±0.124 vs.1.000±0.203,P=0.019);YM1(2.173±0.968 vs.1.000±0.282,P=0.019)和CD206(1.361±0.203 vs.1.000±0.260,P=0.048)的相对表达上调。治疗21 d后双抗组与对照组梗死周边区的小胶质细胞数量差异无统计学意义,但双抗组CD16阳性(M1型)小胶质细胞数量降低(119.4±37.43个/平方毫米vs.220.2±63.07个/平方毫米,P<0.001),CD206阳性(M2型)小胶质细胞数量增加(198.2±40.16个/平方毫米vs.122.8±29.88个/平方毫米,P<0.001),且双抗组小胶质细胞形态上呈多分支网状结构。结论阿司匹林与氯吡格雷联合应用可能通过抑制骨髓中性粒细胞炎症反应,增加脑内小胶质细胞分支,并激活小胶质细胞向抗炎表型(M2型)转化,从而发挥神经保护作用。

毛柳苷在缺血性脑损伤中对白介素4诱导蛋白1表达和小胶质细胞激活及表型的影响

目的探讨毛柳苷在缺血性脑损伤后对白介素4诱导蛋白1(interleukin-4 induced protein 1,IL4I1)表达及小胶质细胞极化的影响。方法38只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(4只)、毛柳苷组(17只)和生理盐水组(17只)。通过线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型(缺血60 min拔栓实现再灌注),再灌注10 min后,毛柳苷组与生理盐水组小鼠分别经尾静脉按照10 mg/kg剂量注射毛柳苷(1 mg/mL)与生理盐水,每天1次,持续28 d。ELISA法检测假手术组及模型组缺血再灌注后48 h、7 d、28 d血清中的IL4I1浓度。采用神经元特异核蛋白(neuronalnuclei,NeuN)抗体免疫荧光染色标记神经元,观察缺血再灌注后7 d脑梗死体积。采用CD16/32、CD206和离子化钙结合适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)免疫荧光染色观察缺血再灌注后7 d小胶质细胞极化状态及突起的长度、数量变化。通过细胞实验探究IL4I1与小胶质细胞不同表型之间的联系。培养小鼠BV2小胶质细胞,设置M0型细胞为空白对照组,使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和INF-γ诱导BV2细胞极化为M1促炎型,使用IL-4和IL-13诱导BV2细胞极化为M2抗炎型细胞。BV2细胞诱导48 h后提取细胞蛋白,通过免疫印迹检测BV2细胞不同表型中IL4I1的表达情况。结果与假手术组相比,生理盐水组脑缺血再灌注后48 h血清中IL4I1浓度下降(P=0.0302);与生理盐水组相比,毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d和28 d血清中IL4I1浓度增加(P=0.0229,P=0.0076)。毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d脑梗死体积较生理盐水组降低(P=0.0389)。与生理盐水组相比,毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d缺血区周围小胶质细胞突起长度、突起数量、突起的分叉点及终末端点数量均增加(P=0.0040,P<0.001,P<0.001,P<0.001),皮层与纹状体区域M1型小胶质细胞数量减少(P=0.0407,P=0.0032),皮层与纹状体区域M2型小胶质细胞数量增多(P=0.0206,P=0.0075)。体外细胞实验BV2小胶质细胞不同表型中,M1型与M2型较M0型IL4I1表达下降(P=0.0008,P=0.0155),与M2型相比,M1型IL4I1表达更低(P=0.0406)。结论毛柳苷可能通过增加脑缺血再灌注损伤后血清及缺血脑组织中IL4I1的表达,并使激活的小胶质细胞向M2抗炎表型转化,减少脑梗死体积,从而发挥神经保护作用。