芒果苷通过PI3K/Akt/mTOR通路对蛛网膜下腔出血后神经细胞的保护作用

目的探讨芒果苷(MF)在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期阶段对神经细胞的保护作用及机制。方法采用小鼠来源神经瘤母细胞(Neuro-2a细胞)和氧合血红蛋白(OxyHb)建立体外SAH模型,分为对照组、蛛网膜下腔出血组(SAH)及芒果苷干预组(MF+SAH)3组,利用免疫荧光检测受损线粒体与溶酶体的结合;利用JC-1和DCFH-DA分别检测线粒体膜电位(Δψm)和活性氧(ROS);Western blot分别检测细胞内磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,胞浆、线粒体中凋亡相关蛋白淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl2关联X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt-C)和Caspase-3的表达。结果与对照组相比,SAH组线粒体膜电位(Δψm)明显去极化(P<0.05),细胞内ROS水平增多(P<0.01),p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达水平显著减少(P<0.05),胞浆内Cyt-C表达水平显著增加(P<0.05),线粒体内Cyt-C表达水平显著减少(P<0.05),Bax和Caspase-3表达水平显著增加(P<0.05),Bcl-2表达水平显著减少(P<0.05);与SAH组相比较,MF+SAH组Δψm和ROS明显恢复(P<0.05),p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达水平明显增加(P<0.05),胞浆内Cyt-C表达水平显著下降(P<0.05),线粒体内Cyt-C表达水平显著增加(P<0.05),Bax和Caspase-3表达显著减少(P<0.05),Bcl-2表达显著增加(P<0.05)。结论芒果苷可以通过稳定线粒体膜电位,减少ROS的产生,改善线粒体功能障碍,从而抑制SAH后早期阶段神经细胞的凋亡。

蛛网膜下腔出血细胞模型应用p38抑制剂后的蛋白组学分析

目的探讨在蛛网膜下腔出血(SAH)早期阶段运用p38抑制剂后神经细胞线粒体蛋白表达的差异。方法采用氧合血红蛋白(OxyHb)刺激Neuro-2a细胞(小鼠来源神经瘤母细胞,购买自中国科学院上海细胞库),模拟SAH后血液中氧合血红蛋白对于神经细胞的刺激状态,建立体外SAH细胞模型,设立对照组(Con)、蛛网膜下腔出血组(SAH)及p38抑制剂组治疗组(p38+SAH组),提取线粒体蛋白进行质谱分析,Maxquant软件和Perseus软件进行查库和非标记定量分析,两组间蛋白差异比较应用t检验。对差异蛋白(p38+SAH/SAH组)进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路的富集分析;应用Multiple Experiment Viewer软件进行分层聚类热图分析;STRING在线工具构建出蛋白与蛋白互作网络(PPI);通过蛋白质印迹法(Western blot)和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证差异蛋白。结果 3组中共筛出239个差异蛋白,上调差异蛋白105个,下调差异蛋白134个(符合差异倍数(FC)>1.5或<0.667,P<0.05)。GO富集分析表明,差异蛋白富集在调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的级联正调控、内吞作用、凋亡过程负调控等细胞生物学功能。在KEGG中:差异蛋白主要在p53信号通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、轴突导向信号等通路富集。通过PPI分析:以Rab7a、Cox5a、Cacybp等蛋白为核心的9个蛋白互作网络SAH组Rab7a的表达低于CON组(蛋白:0.345±0.014比0.226±0.045,t=13.920,P<0.05;mRNA:1.00比0.76±0.04,t=9.813,P<0.05);P38+SAH组中Rab7a的表达高于SAH组(蛋白:0.226±0.045比0.282±0.023,t=-4.768,P<0.05;mRNA:0.76±0.04比0.95±0.02,t=-6.802,P<0.05),与蛋白组学结果一致。结论 p38抑制剂并不是通过单一途径改善SAH后神经细胞线粒体功能障碍,而与多种蛋白及信号通路的调控有关。