长链非编码RNA Crnde通过调节Wnt/β-连环蛋白信号通路影响小鼠成骨细胞增殖的研究

目的观察长链非编码RNA Crnde通过调节Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对小鼠成骨细胞增殖的影响。方法培养MC3T3-E1成骨细胞,随后诱导分化3周,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Crnde表达,应用CRISPR-Cas9方法构建Crnde基因敲除小鼠模型,同时以野生型小鼠作为对照,分为Crnde基因敲除小鼠组(n=25)和野生型小鼠组(n=25),小鼠处死前12 h腹腔注射BrdU进行染色观察成骨细胞增殖,检测血清1型前胶原N末端(P1NP)和Ⅰ型胶原羧基端交联肽(CTX-Ⅰ)表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测骨组织Wnt和β-catenin蛋白表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况,分别运用Osteomeasure系统和MicroCT分析进行骨组织形态计量分析,双荧光素酶报告基因验证Crnde与Wnt蛋白的靶向调节关系。组间比较采用t检验。结果成骨细胞分化过程Crnde表达情况为在诱导的3周时间内,随着时间延长,Crnde表达明显增加,在第3周表达最高(P>0.05);Wnt和β-catenin在Crnde^(-/-)小鼠和正常小鼠中表达情况中,蛋白质印迹法(Western blot)结果显示,Crnde^(-/-)组中Wnt和β-catenin蛋白表达低于WT小鼠组(P<0.05);BrdU免疫荧光染色结果显示,正常对照组小鼠胫骨存在大量BrdU阳性细胞,而Crnde^(-/-)小鼠细胞显著减少;TUNEL染色显示正常对照组小鼠与Crnde^(-/-)小鼠小鼠凋亡成骨细胞数量差异无统计学意义(P>0.05);μCT和Osteomeasure系统结果显示,椎骨的组织形态分析BV/TV,WT组[(19.43±1.53)%],Crnde^(-/-)组[(20.14±1.56)%],Crnde^(-/-)鼠的小梁和皮质骨均显示出低骨量表型,Crnde^(-/-)小鼠的骨形成参数均与野生型小鼠差异有统计学意义(P<0.05);Crnde^(-/-)小鼠血清P1NP和CTX-I分别为(15.62±1.23)μg/L和(12.36±1.12)μg/L,WT小鼠血清P1NP和CTX-Ⅰ分别为(22.81±1.56)μg/L和(16.21±1.21)μg/L,Crnde^(-/-)小鼠组均比WT小鼠组明显下降(P<0.05);双荧光素酶报告基因检测结果显示Crnde模拟物显著降低了野生型组荧光素酶活性(P<0.05),而对突变组荧光素酶活性基本无影响(P>0.05)。结论Crnde通过Wnt/β-catenin信号传导调节骨形成。